張紅梅

(濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟(jì)南 250102)

鼻炎靈片中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢測

張紅梅

(濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟(jì)南 250102)

目的：通過萃取、過固相萃取小柱提取鼻炎靈片中的馬兜鈴酸Ⅰ，并用高效液相色譜法進(jìn)行限量測定。方法：采用Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相：0.3%碳酸銨溶液（用20%鹽酸溶液調(diào)pH至7.5）-乙腈（80∶20），檢測波長：250 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果：馬兜鈴酸Ⅰ在0.006 739～0.1348 μg/mL濃度范圍內(nèi)，馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的峰面積與對照品濃度線性關(guān)系良好（r＝0.999 6，n＝5）；最低檢測限為0.16 ng/mL（信噪比為3∶1）；平均回收率為92.0%，RSD為1.8%（n＝6）。結(jié)論：經(jīng)過本法測定，鼻炎靈片中未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

馬兜鈴酸Ⅰ；鼻炎靈片；高效液相色譜法；限量檢測

鼻炎靈片為炒蒼耳子、辛夷、白芷、細(xì)辛等8味中藥配伍組成，具有透竅消腫，祛風(fēng)退熱的功效，在臨床上用于慢性鼻竇炎、鼻炎及鼻塞頭痛，濁涕臭氣，嗅覺失靈等。方中細(xì)辛含有微量的馬兜鈴酸Ⅰ，馬兜鈴酸Ⅰ為硝基菲羧酸類成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用，但同時又具有蓄積毒性，長期或過量服用易導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性，表現(xiàn)為急、慢性馬兜鈴腎病、腎小管功能障礙等[1-3]。2004年8月，為保證人民群眾的用藥安全，國家食品藥品監(jiān)督管理局根據(jù)對含馬兜鈴酸藥材及其制劑不良反應(yīng)的報道以及毒副作用研究結(jié)果的分析，決定加強(qiáng)對含馬兜鈴酸藥材及其制劑的監(jiān)督管理。為了更有效地控制鼻炎靈片的質(zhì)量，保證臨床用藥安全，本文采用高效液相色譜法對鼻炎靈片中可能含有的馬兜鈴酸Ⅰ，進(jìn)行限度檢查，為其在臨床中的合理應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試劑、試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（1260VWD紫外檢測器，安捷倫公司；二極管陣列檢測器，島津公司）；Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；MS105DU電子分析天平（梅特勒公司），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

馬兜鈴酸Ⅰ對照品（批號：110746-201510，含量：99.1%，中國食品藥品檢定研究院），鼻炎靈片（河南潤弘本草制藥有限公司，批號：140801，140803，140805，140808，規(guī)格：0.3 g/片；山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號：20150702，20150801，2010805，規(guī)格：0.3 g/片；天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司，批號：FP01002，F(xiàn)P01003，F(xiàn)P01006），碳酸銨為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠），乙腈、甲醇均為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為普利斯純凈水，其他試劑均為分析純。4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%碳酸銨溶液（用20%鹽酸溶液調(diào)pH至7.5）-乙腈（80∶20）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果見圖1。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液

取馬兜鈴酸Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含67.388 μg的溶液，作為儲備液，放入冰箱保存。

2.2 供試品溶液

取樣品60片，研細(xì)后，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇150 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，至分液漏斗中，加濃氨溶液5 mL，用三氯甲烷提取3次，每次40 mL，棄去三氯甲烷層，堿液層用20%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至2～3，再用三氯甲烷提取4次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣加甲醇5 mL分次使溶解、洗滌，加至依次用甲醇、水、甲醇各2 mL預(yù)洗的Bond Elut-SAX（Agilent，100 mg， 3 mL）固相萃取小柱上，依次用水、甲醇沖洗至洗滌液無色，棄去洗滌液，再用8%甲酸-甲醇溶液（8→100）4.5 mL洗脫，收集洗脫液至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性對照溶液

照處方制備不含細(xì)辛的陰性對照，再按供試品溶液項下的方法處理，即得。

3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×

圖1 鼻炎靈片中馬兜鈴酸Ⅰ含量的高效液相色譜圖

4 方法學(xué)考察

4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取馬兜鈴酸Ⅰ對照品貯備液溶液（67.388 μg/mL）1.0 mL至l00 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，再用此溶液依次稀釋100，50，25，10，5倍，得系列濃度溶液，按上述液相色譜條件進(jìn)樣20 μL，測得馬兜鈴酸Ⅰ的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

A＝10 697C－19.778，

相關(guān)系數(shù)：r＝0.9996（n＝5），即馬兜鈴酸Ⅰ在0.006 739～0.134 8 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積（A）與對照品濃度（C）線性關(guān)系良好。

4.2 檢測限測定

按上述色譜條件，精密吸取馬兜鈴酸對照品溶液（0.134 μg/mL）用甲醇稀釋進(jìn)樣，結(jié)果表明：當(dāng)馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的信噪比S/N約為3時，馬兜鈴酸Ⅰ濃度為0.16 ng/mL。

4.3 定量限測定

按上述色譜條件，精密吸取馬兜鈴酸對照溶液（0.134 μg/mL）用甲醇稀釋進(jìn)樣，結(jié)果表明：當(dāng)馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的信噪比S/N約為10時，馬兜鈴酸Ⅰ濃度為0.53 ng/mL。

4.4 精密度試驗

照上述的液相色譜條件，精密吸取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液（0.0674 μg/mL）20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測定6次，結(jié)果馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的峰面積RSD（n＝6）為0.9%，表明該方法儀器的精密度良好。

4.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液（0.067 4 μg/mL），分別在0，1，2，4，8，12，24，48 h，照上述的液相色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果馬兜鈴酸Ⅰ色譜峰的峰面積RSD（n＝8）為4.5%，表明對照品溶液中馬兜鈴酸Ⅰ在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

4.6 樣品測定

按照“2.2”項方法制備3個廠家的10批鼻炎靈片供試品溶液，按上述的液相色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ。

4.7 加樣回收率試驗

精密吸取河南潤弘本草制藥有限公司，批號為140803的樣品濾液6份各25 mL，分別精密加入對照品溶液（馬兜鈴酸Ⅰ濃度為0.482 8 μg/mL）1 mL，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按上述的液相色譜條件進(jìn)行測定，用外標(biāo)法計算回收率。結(jié)果供試品中馬兜鈴酸Ⅰ平均回收率為92.0%，RSD為1.8%，表明該測定方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

5 討論與總結(jié)

5.1 結(jié)合文獻(xiàn)報道[4-5]及在二極管陣列檢測器下的測定，選擇了250 nm測定波長，在這個波長下，雜質(zhì)峰相對比較少，而且檢出限相對比較高；并采用基線噪聲小，靈敏度高，峰形良好，與其他成分能達(dá)到基線分離的流動相0.3%碳酸銨溶液（用20%鹽酸溶液調(diào)pH至7.5）-乙腈（80∶20）。

5.2 鼻炎靈片為中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，且馬兜鈴酸Ⅰ含量較低，共存組分干擾多，按照文獻(xiàn)[6-9]本文采用樣品經(jīng)70%甲醇超聲提取，濾液經(jīng)過酸堿處理、萃取濃縮后再經(jīng)固相小柱進(jìn)一步提純、富集。試驗中用兩種固相萃取小柱Bond Elut Plexa（Agilent，60 mg, 3 mL）和Bond Elut-SAX（Agilent ，100 mg，3 mL），結(jié)果經(jīng)液相測定樣品溶液及回收率發(fā)現(xiàn)，前者的雜質(zhì)峰較少，但回收率只有50%左右，后者相對雜質(zhì)峰多，但不影響馬兜鈴酸Ⅰ的測定，且回收率能達(dá)到100%，而單獨用三氯甲烷酸堿提取后，雜質(zhì)峰明顯比過固相小柱要多，且在馬兜鈴酸Ⅰ出峰位置基線不平。

5.3 由于是處方藥難以購得大量樣品進(jìn)行檢測，只進(jìn)行了10批樣品的檢測，經(jīng)過本試驗，3個廠家的10批樣品均未檢出馬兜鈴酸Ⅰ，可見只要按規(guī)定規(guī)范的制劑過程，鼻炎靈片不會含馬兜鈴酸Ⅰ，臨床使用是安全的。

[1] 陳婭娟,吳俏銀,葉惠蘭,等.馬兜鈴酸毒理研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2003,19(2):156-157.

[2] 陳孟蘭,朱正蘭.馬兜鈴屬植物的生物活性和藥理作用研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(3):702-704.

[3] 許海燕,王旭.馬兜鈴酸腎病防治研究進(jìn)展[J].中國實用內(nèi)科雜志,2015,35(1):74-76.

[4] 杜曉曦,周躍華,路金才,等.RP-HPLC法測定馬兜鈴酸含量方法的優(yōu)化[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(7):47-49.

[5] 田夢,瞿俊勇,馬慧,等.馬兜鈴酸檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,45(2):147-149.

[6] 唐秀玲,何頌華,謝譚芳.SPE-HPLC法測定消腫止痛酊中馬兜鈴酸A的含量[J].藥物分析雜志,2012,32(9):1690-1693.

[7] 周雪紅,李志浩,陳銀華,等.SPE-HPLC法測定麻黃止嗽丸中馬兜鈴酸A的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2015,22(14):44-46.

[8] 陳娜娜,李彥超,宋漢敏,等.SPE-HPLC法測定辛芩膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的含量[J].中醫(yī)研究,2014,27(1):72-74.

[9] 薛利華.乳沒鎮(zhèn)痛膠囊中馬兜鈴酸的含量測定研究[J].陜西中醫(yī),2015,36(4):492-493.

本文編輯：魯守琴

Limited Determination of Aristolochic Acid Ⅰ in Biyanling Tablet

Zhang Hong-mei
(Jinan Center for Food and Drug Control, Jinan city, Shandong Jinan 250102,China)

Objective：To establish a HPLC method for detecting the content limit of aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet. Methods：The content limit of aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet was determined by HPLC on a Shim-pack VP-ODS column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with the column temperature at 35℃. The mobile phase was 0.3% ammonium carbonate solution (pH was adjusted to7.5 with 20% hydrochloric acid) - acetonitrile (80∶20, V/V). The detection wavelength was set up at 250 nm. The fow rate was set at 1.0 mL/min, and the injection volume was 20 μL. Results：The determination of aristolochic acid Ⅰ kept the good linearity relation in the content range of 0.006 739 μg/mL～0.134 8 μg/mL (r＝0.999 6, n＝5), the limit of detection was 0.16 ng/mL (SNR of 3∶1), the mean recovery rate was 92.0%, and the RSD was 1.8% (n＝6). Conclusion：Aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet cann’t be determined out.

Aristolochic Acid Ⅰ; Biyanling Tablet; HPLC; Content Limit Determination

R286

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.020

2017 - 04 - 07

張紅梅，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品檢驗及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：zhhm3a@sina.com.cn