李紅偉，鐘淡龍，陳 圓，吳曉燕，鄒志冠

(1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007； 2.廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，廣東 惠州 516021)

惠陽(yáng)胡須雞IGF-Ⅰ和GHRL基因多態(tài)性研究

李紅偉1，鐘淡龍1，陳 圓1，吳曉燕1，鄒志冠2

(1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007； 2.廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司，廣東 惠州 516021)

以IGF-Ⅰ和GHRL基因?yàn)榛蓐?yáng)胡須雞生長(zhǎng)性狀的候選基因，通過(guò)測(cè)序、酶切等方法對(duì)93日齡惠陽(yáng)胡須雞IGF-Ⅰ和GHRL基因多態(tài)性進(jìn)行分析，并用GLM模型分析基因型與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明： IGF-Ⅰ基因在第181位發(fā)生堿基突變，A突變?yōu)镚，屬于同義突變，BsmⅠ酶切分析發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因只有1種基因型，表明該位點(diǎn)在胡須雞保種群中已經(jīng)純合；GHRL基因在第124位發(fā)生堿基突變，T突變?yōu)镚，改變了酶切位點(diǎn)，通過(guò)pflMⅠ酶切分析發(fā)現(xiàn)，GHRL基因有3種基因型，即AA型、AB型和BB型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，93日齡惠陽(yáng)胡須雞3種基因型個(gè)體間體質(zhì)量無(wú)顯著差異。

惠陽(yáng)胡須雞； IGF-Ⅰ基因； GHRL基因； 基因多態(tài)性

惠陽(yáng)胡須雞以特有的優(yōu)良肉質(zhì)和三黃胡須雞的外貌特征而馳名，在育種、生產(chǎn)和外貿(mào)活雞市場(chǎng)上都具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但存在生長(zhǎng)速度慢等缺點(diǎn)。尋找與惠陽(yáng)胡須雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)的候選基因，實(shí)施分子標(biāo)記輔助選擇育種十分必要。

IGF-Ⅰ全稱胰島素樣生長(zhǎng)因子，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)動(dòng)物生命活動(dòng)的重要多肽生長(zhǎng)因子之一[1]。Florini等[2]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因通過(guò)影響肌纖維的分化、增殖和蛋白質(zhì)沉積，間接影響肌肉的生長(zhǎng)速度。趙秀華等[3]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因部分單核苷酸多態(tài)性與京海黃雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)，認(rèn)為可應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇，加快育種進(jìn)程。而劉大林等[4]研究認(rèn)為，IGF-Ⅰ基因可能控制著雞的生長(zhǎng)性狀和屠體性狀或與控制生長(zhǎng)性狀、屠體性狀的主效基因連鎖，可以把IGF-Ⅰ基因作為雞生長(zhǎng)、屠體性狀的輔助標(biāo)記基因。生長(zhǎng)素(ghrelin，GHRL)是促進(jìn)生長(zhǎng)激素(growthhormone，GH)分泌的關(guān)鍵因子，可以調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、增加食欲、調(diào)節(jié)代謝及能量平衡、促進(jìn)胃酸分泌等[5-10]。動(dòng)物饑餓時(shí)，血液中的GHRL量增加，在促進(jìn)攝食的同時(shí)減少了體內(nèi)脂肪的消耗，引起動(dòng)物體質(zhì)量增加[11]。巢湖鴨GHRL基因多態(tài)性與胴體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量和全凈膛質(zhì)量等屠體性狀有顯著相關(guān)性[12]。何丹林等[13]研究表明，雞GHRL基因C2100T位點(diǎn)多態(tài)性與雞的部分生長(zhǎng)性狀存在顯著相關(guān)性。Fang等[14]研究表明，GHRL基因外顯子1處的8bp插入缺失多態(tài)性與雞生長(zhǎng)性狀和屠體性狀顯著相關(guān)，而GHRL基因部分單核苷酸多態(tài)性與雞腹脂質(zhì)量、腿肌粗蛋白含量顯著相關(guān)[15]。

綜上可知，IGF-Ⅰ和GHRL基因與雞生長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)。因此，以IGF-Ⅰ和GHRL基因?yàn)榛蓐?yáng)胡須雞生長(zhǎng)性狀的候選基因，分析IGF-Ⅰ和GHRL基因多態(tài)性及其與體質(zhì)量的關(guān)系，以期為今后惠陽(yáng)胡須雞育種中生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

100份93日齡的惠陽(yáng)胡須雞血樣采自廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司的惠陽(yáng)胡須雞保種場(chǎng)。將血樣放入含肝素鈉的采血管，-20 ℃保存。

1.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

IGF-Ⅰ基因引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[3]，GHRL基因引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[15]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 IGF-Ⅰ基因和GHRL基因的引物序列

IGF-Ⅰ、GHRL基因的PCR擴(kuò)增體系均為25μL：GreenMix12.5μL，無(wú)菌水10.5μL，上、下游引物各0.5μL，基因組DNA1μL。

IGF-Ⅰ基因擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30s，53.5 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10min；10 ℃保存。GHRL基因擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2min30s；94 ℃變性30s，52.0 ℃退火45s，72 ℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10min；10 ℃保存。

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送到廣州華大基因公司，利用ABI-3T30儀器進(jìn)行測(cè)序。

1.3基因型檢測(cè)

IGF-Ⅰ基因酶切反應(yīng)體系為20μL：BsmⅠ酶0.5μL，10×NEBuffer2μL，PCR產(chǎn)物17.5μL。65 ℃條件下反應(yīng)15min。GHRL基因酶切反應(yīng)體系為20μL：pflMⅠ酶0.5μL，10×NEBuffer2μL，PCR產(chǎn)物17.5μL。37 ℃條件下反應(yīng)15min。酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像分析儀拍照并進(jìn)行基因分型。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)不同基因型個(gè)體的數(shù)量，計(jì)算基因型頻率，并對(duì)多態(tài)性片段的基因型分布進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)。利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的GLM模型對(duì)基因多態(tài)性與體質(zhì)量間的相關(guān)性進(jìn)行最小二乘分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1IGF-Ⅰ、GHRL基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖1和圖2可以看出，IGF-Ⅰ、GHRL基因特異性擴(kuò)增良好，沒有出現(xiàn)非特異性條帶和引物二聚體，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小相符，可以進(jìn)一步用來(lái)測(cè)序和酶切鑒定。

M.DNA Marker； 1—6.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 IGF-Ⅰ基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M.DNA Marker； 1—5.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖2 GHRL基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2IGF-Ⅰ、GHRL基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)IGF-Ⅰ基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)在第181位，由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致密碼子GAA突變?yōu)镚AG，但沒有改變編碼氨基酸，屬于同義突變。同時(shí)，對(duì)突變位點(diǎn)限制性酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，未突變的IGF-Ⅰ基因能被BsmⅠ酶切，突變后的IGF-Ⅰ基因則不能被切開?？梢?，突變改變了酶切位點(diǎn)。

對(duì)GHRL基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10個(gè)突變位點(diǎn)，分別在第124位(T→G)、125位(T→G)、234位(T→C)、262位(G→A)、410位(G→A)、421位(G→A)、450位(G→A)、480位(G→A)、510位(G→A)、519位(G→A)。這些突變位點(diǎn)都不在GHRL基因編碼區(qū)上，因此不改變氨基酸序列。但對(duì)突變位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，第124位的堿基突變影響了pflMⅠ酶切位點(diǎn)，未突變的GHRL基因能被pflMⅠ切開，而突變后的GHRL基因則

不能被切開。

2.3IGF-Ⅰ、GHRL基因的基因型分析結(jié)果

IGF-Ⅰ基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)BsmⅠ酶切后發(fā)現(xiàn)，只存在1種基因型(圖3)。因此，不需要進(jìn)行該基因型分布的卡方適合性檢驗(yàn)以及基因型與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析。

GHRL基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)pflMⅠ酶切(圖4)，發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別為BB、AB、AA基因型。其中，BB型樣本41個(gè),AB型18個(gè),AA型41個(gè)。

M.DNA Marker; 1—7.酶切產(chǎn)物圖3 IGF-Ⅰ基因PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果

圖4 GHRL基因PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果

2.4GHRL基因多態(tài)性分析

惠陽(yáng)胡須雞GHRL基因AA、AB、BB型3種基因型及等位基因的頻率見表2，A和B等位基因的頻率均為0.5；χ2適合性檢驗(yàn)表明，該位點(diǎn)沒有處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，表明該基因沒有處于遺傳平衡狀態(tài)。

表2 惠陽(yáng)胡須雞GHRL基因的基因型和等位基因頻率

2.5GHRL基因型與惠陽(yáng)胡須雞體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，GHRL基因多態(tài)性與93日齡惠陽(yáng)胡須雞體質(zhì)量不存在顯著相關(guān)性，3種基因型個(gè)體體質(zhì)量間的差異均不顯著。

表3 GHRL基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1IGF-Ⅰ基因與GHRL基因多態(tài)性

SNPs指基因組中某個(gè)單核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括DNA中的堿基替換、顛換(嘧啶和嘌呤之間的替換)、單個(gè)堿基的插入或缺失等的變化。趙秀華等[3]在京海黃雞中發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因外顯子3序列的60bp處有A→G突變，屬于同義突變，χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)顯示，京海黃雞在該位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。丁馥香等[16]在邊雞中發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅰ基因第3外顯子區(qū)域存在2個(gè)堿基的突變，一個(gè)是同義突變，另一個(gè)突變導(dǎo)致了編碼氨基酸的改變。Amills等[17]對(duì)雞IGF-Ⅰ基因 5′側(cè)翼區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)了A→C突變。這些結(jié)果說(shuō)明，雞IGF-Ⅰ基因第3外顯子為易發(fā)生突變的區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，在惠陽(yáng)胡須雞的IGF-Ⅰ基因第3外顯子區(qū)域中檢測(cè)到1個(gè)突變位點(diǎn)(A→G)，屬于同義突變，改變了BsmⅠ酶切位點(diǎn)。通過(guò)酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)只有1種基因型，推測(cè)該基因位點(diǎn)在該胡須雞保種群中已經(jīng)純合。

Nie等[15]在5個(gè)中外雞品種和1個(gè)F2代群體中，通過(guò)對(duì)GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)SNPs。方梅霞等[18]在杏花雞×隱性白洛克雞F2代資源群體中，用同樣的引物對(duì)GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)相同的6個(gè)SNPs。本研究中，用同樣的引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，在GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)SNPs，其中5個(gè)為未曾報(bào)道的新SNPs。以上結(jié)果提示，GHRL基因5′側(cè)翼區(qū)為堿基突變的熱點(diǎn)區(qū)域。有研究表明，非編碼區(qū)存在著影響基因表達(dá)調(diào)控的元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，也是基因反式作用因子的特異結(jié)合區(qū)域[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)的這些突變位點(diǎn)的變異是否影響GHRL的基因轉(zhuǎn)錄效率需要進(jìn)一步研究。

3.2GHRL基因多態(tài)性對(duì)惠陽(yáng)胡須雞生長(zhǎng)性狀的影響

近年來(lái)，關(guān)于GHRL基因的多態(tài)性與動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)、脂肪沉積等的相關(guān)性研究已經(jīng)成為家禽育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)。羅開鵬等[20]研究表明，GHRL基因突變位點(diǎn)(C345T)影響貴州黑山羊生長(zhǎng)性狀，該位點(diǎn)有望作為山羊生長(zhǎng)性狀的一個(gè)標(biāo)記輔助選擇位點(diǎn)。雞GHRL基因C2100T位點(diǎn)多態(tài)性與雞的部分生長(zhǎng)性狀存在顯著相關(guān)性[13]。

本研究分析了GHRL基因與93日齡惠陽(yáng)胡須雞體質(zhì)量的關(guān)系，BB基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量較AA基因型高，但3種基因型個(gè)體間體質(zhì)量無(wú)顯著差異。由于本研究樣本量偏少，且只有1個(gè)日齡的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，可能會(huì)影響分析結(jié)果，所以需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，收集多個(gè)日齡的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析惠陽(yáng)胡須雞3種基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，以確定優(yōu)勢(shì)基因型，為今后惠陽(yáng)胡須雞育種中生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

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StudyonSingleNucleotidePolymorphism(SNP)ofIGF-ⅠandGHRLGeneinHuiyangBeardedChickens

LIHongwei1,ZHONGDanlong1,CHENYuan1,WUXiaoyan1,ZOUZhiguan2

(1.DepartmentofLifeScience,HuizhouUniversity,Huizhou516007,China;2.GuangdongJinzhongAgricultureandAnimalHusbandryCo.,Ltd.,Huizhou516021,China)

In this study,IGF-ⅠandGHRLgeneswerechosenascandidategenesofgrowthtraitsinHuiyangbeardedchicken.Sequencingandenzymedigestionwereappliedtoassessthesinglenucleotidepolymorphismofthetwogenesandthegenerallinearmodelwasusedtoanalyzeassociationbetweendifferentgenotypesandbodyweightonthe93rddayinHuiyangbeardedchicken.Theresultsshowedthatonemutation(A181G)wasfoundinIGF-Ⅰgene,butthemutationwassynonymous.OnlyonegenotypewasdetectedbyBsmⅠenzymedigestioninIGF-Ⅰgene,whichindicatedthatthemutationsitehadbeenhomozygousintheconservationpopulationofHuiyangbeardedchicken.Theresultsalsoshowedthatonemutation(T124G)wasdetectedinGHRLgene.ThemutationchangedthecuttingsiteofpflMⅠenzyme.Threegenotypes(AA,AB,BB)oftheGHRLgeneweredetectedbythepflMⅠenzymedigestion.TheassociationanalysesshowedthattherewasnosignificantdifferenceamongindividualswiththreegenotypesinHuiyangbeardedchickenonthe93rdday.

Huiyangbearedchicken； IGF-Ⅰgene； GHRLgene；geneticpolymorphism

2017-03-16

廣東省普通高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目(2014KTSCX178)；惠州學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(156020021)

李紅偉(1972-),男,云南祿豐人,講師,博士,主要從事家禽遺傳育種研究。E-mail:lhwcau@163.com

S831

：A

： 1004-3268(2017)09-0152-04