撥法對CCI模型大鼠外周血清中IL-1β以及脊髓中5-HT2A表達的影響

陶艷紅 姚斌彬 于天源 馬馳 魯夢倩 張林峰 呂桃桃 吳帥

·論著·

撥法對CCI模型大鼠外周血清中IL-1β以及脊髓中5-HT2A表達的影響

陶艷紅 姚斌彬 于天源 馬馳 魯夢倩 張林峰 呂桃桃 吳帥

目的從行為學和形態(tài)學角度探索撥法對CCI模型大鼠感覺功能恢復的影響。方法采用推拿手法模擬儀定性、定量模擬手法，對CCI模型大鼠進行干預。通過光熱耐痛閾分析大鼠行為學改善情況，ELISA法測定血清中IL-1β含量的變化，Western blot法檢測脊髓中5-HT2A受體的相對蛋白表達情況。結(jié)果撥法治療組造模后7天的光熱耐痛閾數(shù)值與模型組無差異(P>0.05)，經(jīng)過撥法治療20次后(即造模后28天)，二者之間有顯著差異(P<0.05)，且撥法組逐漸接近正常組水平。ELISA法檢測血清中IL-1β的含量：造模后7天，模型組和撥法組IL-1β含量均顯著高于正常組，經(jīng)過撥法治療20次后，撥法組IL-1β與模型組相比顯著性下降(P<0.05)。Western blot法測定脊髓中5-HT2A的相對蛋白表達含量:撥法治療20次后，撥法組脊髓中5-HT2A相對蛋白表達含量明顯上調(diào)，且已接近正常組水平(P>0.05)，高于模型組水平(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)過撥法治療，可明顯上調(diào)CCI模型大鼠的光熱耐痛閾值，減輕其痛覺過敏狀態(tài)；下調(diào)CCI模型大鼠外周血清中促炎性細胞因子IL-1β的表達，達到“消炎鎮(zhèn)痛”的作用；上調(diào)脊髓中5-HT2A受體的表達，對中樞鎮(zhèn)痛起到一定作用。

撥法； 神經(jīng)病理性疼痛； 坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型； 白細胞介素1β； 五羥色胺2A受體

周圍神經(jīng)損傷是臨床中的常見病癥，其可引起神經(jīng)病理性疼痛[1](neuropathic pain， NPP)已被證實，主要以痛覺過敏、自發(fā)性疼痛、異常疼痛等感覺功能障礙為主要表現(xiàn)。由于其發(fā)病的多樣化，發(fā)病機制尚未闡明，故為科研課題中的難點之一。本團隊前期實驗研究表明，推拿干預治療是一種安全性高、非侵襲性的非藥物治療方法，其能有效改善周圍神經(jīng)損傷大鼠的行為學指標，促進軸漿運輸功能的恢復，促進軸突再生及神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達[2]，保護神經(jīng)元，修復神經(jīng)髓鞘[3]等，然而關(guān)于推拿干預的效應機制尚不完全明確。本實驗采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)模型[4]大鼠，通過觀察其行為學的改變，應用ELISA法以及Western blot法，檢測推拿干預后血清中促炎性細胞因子IL-1β[5]以及脊髓中5-HT2A受體[6-7]蛋白的表達情況，定性定量地探討撥法對周圍神經(jīng)操作功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取清潔級SD大鼠(由北京思貝福實驗動物科技有限公司提供)，實驗動物許可證號：SCXK(北京)2011-0004，體重(160±10)g，雄性，48只。購入后，適應性飼養(yǎng)1周。之后采用完全隨機設計法，利用隨機數(shù)字表將48只SD大鼠隨機分為4組，即正常組12只、假手術(shù)組12只、模型組12只、撥法組12只。

1.2 造模方法

1.2.1 器械 手術(shù)剪、止血鉗、鑷子、小號持針器、棉簽、燒杯、托盤、5 mL注射器、一次性塑膠手套、口罩、醫(yī)用縫合針及非吸收性外科縫線(上海醫(yī)用縫合針廠)、薇喬抗菌縫線4～0[8]。

1.2.2 藥品 水合氯醛(天津市福晨化學試劑廠)、碘伏消毒液(北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠有限公司出品)、甲醛溶液(廣東汕頭市西隴化工廠)、0.9%氯化鈉注射液。

1.2.3 造模 假手術(shù)組：分離暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)中段、不結(jié)扎，逐層消毒后行常規(guī)縫合。模型組、撥法治療組：按照Bennett和Xie的方法，建立CCI動物模型。(1)10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠；(2)大鼠右側(cè)俯臥位置于鼠板上，以右側(cè)股骨中點為中心，2 cm為直徑，備皮、消毒；(3)從左側(cè)大腿中部股骨外緣與股骨平行的方向切開皮膚；(4)肌間隙鈍性分離肌間筋膜；(5)暴露坐骨神經(jīng)主干；(6)在坐骨神經(jīng)分叉前游離6 mm左右，(7)用4～0鉻制羊腸線間隔1 mm環(huán)繞結(jié)扎4道，松緊程度以引起小腿肌肉輕微顫動且不影響神經(jīng)外膜血運為宜。(8)術(shù)畢，生理鹽水沖洗，逐層消毒，縫合皮膚。(9)術(shù)后將大鼠置于保溫毯上，等待蘇醒，禁食禁水24小時。

1.3 治療方法

正常組： 常規(guī)喂養(yǎng)。假手術(shù)組： 行假手術(shù)，常規(guī)喂養(yǎng)。模型組：慢性坐骨神經(jīng)壓窄性損傷造模，不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)。撥法治療組： (1)治療方法： 于造模后第7天開始治療。每天用按摩推拿手法模擬儀(專利號：200710187403.1)定性模擬撥法，依次刺激大鼠患側(cè)殷門、承山、陽陵泉穴。每穴各刺激3分鐘，每只總計9分鐘。按摩頭為光滑的接觸面，直徑10 mm。(2)治療次數(shù)： 每天1次，共20次。

1.4 指標檢測

1.4.1 行為學檢測 光熱耐痛閾檢測：評價大鼠溫度覺和痛覺恢復情況。測試過程需保持安靜，室溫20～25℃。測試前將大鼠置于檢測盒內(nèi)，待其適應環(huán)境后，用輻射燈光源照射其足跖中后1/3處，按下開始按鈕，待大鼠抬腳時計時自動停止，記錄此時時間，作為大鼠熱痛縮腿反應潛伏期。為防止大鼠組織熱灼傷，設定光源自動切斷時間為20秒。每側(cè)下肢測定2次，取其平均值。

1.4.2 形態(tài)學坐骨神經(jīng)HE染色 將展片40℃恒溫烤箱中烤片12小時，烤干備用；使用二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；水洗3分鐘；蘇木精染液染色3分鐘，以染核；再水洗3分鐘；鹽酸乙醇分色3～5秒。帶粉紅色后立即取出；水洗30秒；在碳酸鋰飽和液中提插10下，細胞核變?yōu)樗{色后水洗1分鐘；伊紅染液染色1分鐘后水沖洗；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。

1.4.3 ELISA法檢測 采集大鼠腹主動脈血5 mL，室溫靜置約1～2小時后，用離心機以3000 r/min離心15分鐘，即可分離出血清，移液槍取出血清，-20℃封存待用。采用ELISA試劑盒測定血清中IL-1β 濃度。

1.4.4 Western blot法檢測 取大鼠L3～L5腰膨大脊髓背角，稱量50～100 mg組織放在玻璃勻漿器中，加入500～l000 μL RIPA裂解液，裂解液中加PMSF(1 mM)，在冰上進行勻漿，直至勻漿充分無塊狀；提取蛋白，棄去沉淀，-80℃保存?zhèn)溆?。進行蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜封閉劑雜交，曝光鑒定，進行掃描膠片，用Quantity One圖像分析軟件分析目標條帶的光密度值。

以上每項指標檢測均每組隨機選取6只大鼠進行。

1.5 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，率的比較用卡方檢驗，均數(shù)比較用方差分析，組間兩兩比較方差齊時用Bonferroni檢驗，方差不齊時用Tamhane’s T2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠患肢光熱耐痛閾的變化情況

各組大鼠光熱耐痛閾結(jié)果(見表1)：造模后7天的撥法組、模型組與正常組相比，閾值明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷后，大鼠出現(xiàn)熱痛覺過敏現(xiàn)象，對感覺功能造成一定影響。假手術(shù)組與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明只切開肌肉，未結(jié)扎坐骨神經(jīng)的大鼠一周左右的時間即可逐漸恢復。撥法治療20次(28天)后，撥法組的光熱耐痛閾值雖然仍低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但其與模型組的光熱耐痛閾值相比，已有顯著性升高(P<0.05)，說明撥法可以減輕CCI模型大鼠的痛覺過敏狀態(tài)。

表1 各組大鼠光熱耐痛閾比較秒)

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 光鏡觀察HE染色結(jié)果

造模后7天：正常組、假手術(shù)組可見完好無損的髓鞘及軸索；模型組軸索崩解。

撥法治療20次：正常組、假手術(shù)組可見結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)纖維髓鞘及軸索；模型組軸索崩解，髓鞘破碎；撥法組鏡下可見有序排列的神經(jīng)纖維以及清晰完整的軸索。見圖1。

圖1 各組大鼠勢撥法治療20次后坐骨神經(jīng)形態(tài)觀察(×400)

2.3 血清IL-1β的含量

CCI模型大鼠血清IL-1β的含量比較結(jié)果(見表2)：造模后7天的撥法組、模型組與正常組相比，血清中IL-1β表達上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；假手術(shù)組與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。撥法治療20次后，撥法組大鼠血清中IL-1β雖與正常組有一定差距(P<0.05)，但與模型組相比已有顯著性下降(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-1β的含量比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 脊髓中5-HT2A的蛋白相對表達情況

CCI模型大鼠脊髓中5-HT2A蛋白相對表達量結(jié)果(見表3、圖2)：造模后7天，撥法組與模型組相比，CCI模型大鼠脊髓中5-HT2A受體蛋白的表達量無差異(P>0.05)；二者與正常組相比，蛋白表達明顯下降(P<0.05)。撥法治療20次后，撥法組大鼠脊髓中5-HT2A受體蛋白表達含量與正常組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但撥法組與模型組相比，5-HT2A蛋白表達含量已明顯上調(diào)(P<0.05)。

表3 各組大鼠脊髓中5-HT2A蛋白相對表達量的比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖2 各組大鼠脊髓中5-HT2A蛋白Western Blot條帶分析結(jié)果圖

3 討論

隨著推拿臨床醫(yī)技的發(fā)展，推拿所治療的疾病范圍逐漸拓寬，但臨床中以頸椎病、腰椎間盤突出等傷科類疾病較為多見，這些疾病的發(fā)展或多或少都會累及周圍神經(jīng)的損傷。而周圍神經(jīng)損傷臨床癥狀主要表現(xiàn)為感覺功能與運動功能障礙，周圍神經(jīng)損傷患者常因病灶局部或四肢遠端的疼痛、麻木、無力等主訴就診，運用推拿治療，可針對病變部位及受累部位，進行“局部-整體”的結(jié)合治療，能夠緩解、治療患者的疼痛，取得滿意的療效。同時因其痛苦小、療效好、無不良反應，已逐漸受到患者的認可，成為臨床上傷科類疾病非手術(shù)療法中最為常用的治療手段。中醫(yī)學認為疼痛多由經(jīng)絡循行受阻、氣血瘀滯所致，即不通則痛。撥法是運用較廣的外治法之一，對于緩解肌肉的痙攣作用性強，傷科疾病中應用十分廣泛，當作用于神經(jīng)干處，可以通過撥動神經(jīng)干及周圍肌肉韌帶，達到治療遠端肢體的麻木或疼痛癥狀[9]的作用。本次研究為推拿解決感覺功能障礙的機理研究，因此選用撥法，相對其他手法，能更加直接、有效地作用于治療部位，針對性更強。

有相關(guān)研究表明，外周感受區(qū)的NPP常伴有炎癥反應{10}，在相應的損傷部位可檢測到炎性介質(zhì)；另有研究證實抗炎癥藥物能夠減輕慢性NPP[11]，認為炎癥因子在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛中具有重要作用。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β是促炎性細胞中的代表性因子[12]，其作用與疼痛關(guān)系密切，尤其影響慢性疼痛的發(fā)生與發(fā)展過程。外周刺激可降低血清中IL-1β的含量，從而起到消除炎癥的作用。本實驗研究結(jié)果顯示，經(jīng)過撥法治療20次后，撥法組的IL-1β與模型組相比有顯著性下降，說明撥法干預可以下調(diào)促炎性細胞因子IL-1β的表達，進而起到“消炎鎮(zhèn)痛”的作用。

5-HT是生物體內(nèi)廣泛分布的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如疼痛、焦慮、抑郁、偏頭痛、高血壓、嘔吐等，其中5-HT與疼痛的關(guān)系備受關(guān)注。5-HT受體可分為7種亞型，即5-HT1-7受體，其中5-HT2受體又可分為5-HT2A受體、5-HT2B受體和5-HT2C受體(5-HT2A受體參與疼痛的產(chǎn)生或調(diào)控已被證實)。大量疼痛模型的實驗也表明5-HT2A受體是傷害性信息向中樞傳遞的重要神經(jīng)遞質(zhì)[13]，在大鼠的脊髓中，外周刺激如電針、火針等，可使5-HT2A受體的表達增加，產(chǎn)生突觸后抑制作用，繼而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[14]。本實驗研究結(jié)果顯示，撥法治療20次后，撥法組脊髓中5-HT2A相對蛋白表達含量明顯上調(diào)，且已接近正常組水平(P>0.05)，高于模型組水平(P<0.05)，說明作為外周刺激的一種方式，撥法可刺激5-HT2A受體在脊髓中的表達，從而起到中樞鎮(zhèn)痛作用。

本次實驗結(jié)果揭示，經(jīng)過撥法治療，可明顯減輕CCI模型大鼠的痛敏狀態(tài)，修復受損的軸突；下調(diào)血清中促炎性細胞因子IL-1β的表達，達到“消炎鎮(zhèn)痛”的作用；上調(diào)脊髓中5-HT2A受體的表達，對中樞鎮(zhèn)痛起到一定作用。雖然撥法通過CCI模型大鼠探究NPP相關(guān)疾病的治療過程取得了一定成果，但仍需進一步全面深入地研究，以期更加清晰地闡明其作用機制，開拓更廣泛的應用前景。

[9] 于天源，林彩霞，付國兵，等.按摩推拿學[M].3版.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2012.

(本文編輯： 董歷華)

EffectofBo’famethodontheexpressionofIL-1βinperipheralserumand5-HT2AinspinalcordofCCImodelrats

TAOYanhong，YAOBinbin，YUTianyuan，etal.

SchoolofAcupunctureMoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor:YUTianyuan,E-mail:yutianyuan@sina.com

ObjectiveExplore the effects of Bo’fa method on the recovery of sensory function of the CCI model rats from the behavior and morphology.MethodsThe CCI model rats were intervened qualitatively and quantitatively by the massage simulation instrument. The variation of rats’ behavior was analyzed through the solar-thermal pain threshold. The changes of the IL-1β in the serum were measured by ELISA. And we detected the relative protein expression of 5-HT2Areceptor in the spinal cord by Western blot.ResultsThere was no significant difference in the results of solar-thermal pain threshold between the Bo’fa method group and the model group at the 7thday after modeling (P>0.05). After twenty times of Bo’fa method treatment, the difference between the two groups became statistically significant (P<0.05), and the results were at or near the normal group level. At the 7thday after modeling, the levels of IL-1β in serum measured by ELISA in the model group and the Bo’fa method group were significantly higher than those in the normal group. After 20 times of Bo’fa method treatment, the levels of IL-1β in the Bo’fa method group declined significantly compared with those in the model group(P<0.05). The relative protein expression of 5-HT2Ain the spinal cord was measured by the method of Western blot. The results of this experiment indicated that, after 20 times of Bo’fa method treatment, the relative protein expression of 5-HT2Ain the spinal cord in the Bo’fa method group increased significantly higher than that in the model group (P<0.05), and became close to that in the normal group (P>0.05).ConclusionBo’fa method treatment can increase obviously the values of solar-thermal pain threshold of CCI model rats, ease the recovery of sensory function, decrease the expression of pro-inflammatory cytokine IL-1β in peripheral serum of the CCI model rats to eliminate the inflammation of NPP. Moreover, Bo’fa method can increase the expression of 5-HT2Areceptor in the spinal cord, playing an important role in the analgesia of central nerves.

Bo’fa method； Neuropathic pain； CCI model； IL-1β； 5-HT2A

國家自然科學基金青年基金(81403497)；國家自然科學基金(81373759)

100029 北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院[陶艷紅(碩士研究生)、姚斌彬、于天源、馬馳(碩士研究生)、魯夢倩、張林峰(碩士研究生)、呂桃桃(碩士研究生)、吳帥(碩士研究生)]

陶艷紅(1991- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：推拿治療周圍神經(jīng)損傷的機理研究。E-mail：635421798@qq.com

于天源(1965- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：推拿治療周圍神經(jīng)損傷的機理研究。E-mail：yutianyuan@sina.com

R244

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.001

2016-11-23)