陳小芳， 于德花， 寧 凱， 徐化凌， 畢云霞

(東營市農(nóng)業(yè)科學研究院， 山東 東營 257091)

我國是世界鹽堿地大國之一，約有667萬hm2鹽堿地[1]，過度的開發(fā)利用致使次生鹽堿地面積還在不斷擴張[2-4]，土壤鹽漬化問題是我國乃至世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都面臨的困境，同時也對生態(tài)環(huán)境和社會經(jīng)濟造成嚴重危害。改良鹽漬土過程復雜、難度大、耗時長，種植耐鹽牧草是最為有效、經(jīng)濟的改良措施。苜蓿(Medicagosativa. L)葉片具有排鹽機制[5]，耐鹽能力較強，利用品種間的耐鹽性差異培育耐鹽良種，可在改良鹽堿地的同時，提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料，為鹽堿地農(nóng)牧業(yè)發(fā)展拓寬道路。

植物的耐鹽性與其遺傳因素及個體的發(fā)育階段有關，種子能夠在鹽脅迫下萌發(fā)成苗，是植株在鹽堿地成功定植的基礎[6-8]。苜蓿耐鹽機制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用由特定的基因型決定，而且調(diào)節(jié)機制會隨分化水平的變化而變化[9]。鹽堿地中生長的苜蓿，各生長發(fā)育階段都會受到鹽脅迫的影響，其中對鹽脅迫最敏感的時期為種子萌發(fā)期，由于地表土壤和地下土壤的鹽度相差大約2～10倍，因而苜蓿種子萌發(fā)期面臨的鹽脅迫遠大于其他生長發(fā)育階段，苜蓿種子發(fā)芽期耐鹽性評價對耐鹽性苜蓿材料的選擇和培育至關重要[10]，這與Al-khatib等[11]、劉卓和徐安凱[12]部分研究結(jié)論一致。本試驗以23份苜蓿種質(zhì)為材料，研究其種子在不同鹽濃度脅迫下的萌發(fā)特性，通過對各項指標與耐鹽性的相關性分析，篩選出苜蓿耐鹽能力鑒定簡潔有效的指標，為今后的耐鹽性評價及耐鹽苜蓿品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年7月-2016年11月進行，共23份苜蓿種質(zhì)，分別來源于中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所、山東農(nóng)業(yè)工程學院、斯洛文尼亞農(nóng)業(yè)研究所，種子名錄及來源如表1所示。

表1 苜蓿種質(zhì)名錄及來源Table 1 List of alfalfa germplasms and origins

1.2 試驗方法

根據(jù)《牧草種子檢驗規(guī)程》[13]選取成熟、大小一致、健康種子為試驗材料，選用化學純NaCl配制0.20%，0.40%，0.60%，0.80%，1.00%，1.20%和1.40%質(zhì)量分數(shù)的鹽溶液(蒸餾水為對照)，每梯度設置3個重復。供試種子用0.50%的次氯酸鈉表面消毒5 min，蒸餾水沖洗干凈，在直徑100 mm的培養(yǎng)皿中均勻擺放100粒種子，加入4.5 mL NaCl溶液，用封口膜封好，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)。

1.3 測定指標及方法

發(fā)芽勢從第4 d開始統(tǒng)計，以后每隔一天統(tǒng)計一次，第8 d最后一次統(tǒng)計；發(fā)芽率在培養(yǎng)第10 d統(tǒng)計；處理12 d后，測定根長和苗高，每個重復隨機選取10株苗。按照下列方法計算各項指標：

發(fā)芽指數(shù)(GI)=ΣGt/Dt(Gt表示處理后t日的發(fā)芽數(shù)，Dt表示相應的發(fā)芽日數(shù))；

活力指數(shù)(VI)=GI×S(GI為發(fā)芽指數(shù)，S為平均根長)；

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1)隸屬函數(shù)分析：

對于不同的測定指標來說，有的指標變化的最大值與最小值之間差異非常大，因而該指標的絕對值在參與整個評價過程中所占的比重就比較大，對評價結(jié)果影響也就比較大[14]；而有的指標品種間差異比較小，則該指標的絕對值在綜合評價過程中的貢獻就可能比較小。這樣就可能錯誤擴大或縮小某一個性狀與品種品質(zhì)的相關性。根據(jù)隸屬函數(shù)的方法，對各品種各個指標求其隸屬值并累加，綜合比較各個品種，可消除因絕對值大小不同而可能造成的對正確評價材料優(yōu)劣所作的貢獻的不同[15]。

(1)

(2)

Yij為i品種的j指標的隸屬函數(shù)值，Xij為i品種的j指標的均值，Xjmax為各品種j指標均值的最大值，Xjmin為各品種j指標均值的最小值。若j指標與耐鹽性成正相關，則用公式(1)；若j指標與耐鹽性成負相關，則用公式(2)[16]。

2)采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理，用DPS V6.55統(tǒng)計分析軟件進行方差分析、聚類分析和相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種苗耐鹽性測定

2.1.1鹽脅迫對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響 發(fā)芽勢表征種子萌發(fā)初期的發(fā)芽力。方差分析表明(表2)，在相同NaCl鹽濃度下各苜蓿種質(zhì)的發(fā)芽勢均呈極顯著差異(P<0.01)。23個苜蓿種子發(fā)芽勢大體上隨著鹽濃度的增加而降低，說明脅迫作用越強種子的發(fā)芽能力越弱。0.20%，0.40%，0.60%鹽濃度下，分別有11、13、11份種質(zhì)的種子發(fā)芽勢高于對照，當鹽濃度達到0.80%和1.00%時，只有9份和5份種質(zhì)的種子發(fā)芽勢高于對照，其他的都降低。隨著NaCl鹽濃度進一步增加，到1.20%時除‘4030’略微高于對照外，所有苜蓿種質(zhì)種子發(fā)芽勢均明顯低于對照，‘游客’降幅最大，達85.41%。

表2 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿種子發(fā)芽勢的影響Table 2 Effects of different NaCl concentration on the germination potential of alfalfa germplasms

續(xù)表2

注：同列不同小寫字母表示各品種間差異顯著(P<0.05)；*表示在0.05水平上差異顯著：**表示在0.01水平上差異極顯著，下同

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level. * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as below

相同NaCl濃度下，不同種質(zhì)間發(fā)芽率差異達極顯著水平(P<0.01)(表3)。0.20%，0.40%和0.60%鹽濃度下，分別有9份、13份和13份種質(zhì)的種子發(fā)芽率高于對照，當鹽濃度達到0.80%時，只有7份種質(zhì)的種子發(fā)芽勢高于對照。隨著NaCl鹽濃度進一步增加，到1.00%時所有苜蓿種質(zhì)的種子發(fā)芽勢均明顯低于對照，‘游客’降幅最大，達41.59%，說明1.00%鹽濃度極大的限制了苜蓿種子的萌發(fā)。

表3 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿種子發(fā)芽率的影響Table 3 Effects of different NaCl concentration on the germination rate of alfalfa germplasms

續(xù)表3

2.1.2鹽脅迫對苜蓿根長的影響 研究脅迫環(huán)境對種子萌發(fā)的影響時，多以根的生長作為指標之一[17]。方差分析表明，在相同NaCl鹽濃度下各種質(zhì)的根長差異極顯著(P<0.01)。與發(fā)芽率相比，隨著NaCl濃度的升高，只有部分種質(zhì)幼根伸長受到抑制(表4)。NaCl鹽濃度為0.40%，0.60%，0.80%和1.00%時，所有試驗材料根長均大于對照，0.60%時根長達到最大，說明低鹽溶液一定程度上促進幼根生長。隨著NaCl濃度的增加，促進作用逐漸減弱，當NaCl濃度為1.20%時，有13份種質(zhì)幼根均低于對照，隨著NaCl鹽濃度進一步增加，到1.40%時,除‘中苜3號’和‘巨能2’外，所有苜蓿種質(zhì)根長均明顯低于對照，‘金皇后’降幅最大，達65.92%，說明‘中苜3號’和‘巨能2’耐鹽性更強。

表4 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿根長的影響Table 4 Effects of different NaCl concentration on the radicle growth of alfalfa

續(xù)表4

2.1.3鹽脅迫對苜蓿苗高的影響 方差分析表明，相同NaCl濃度下不同種質(zhì)間苗高呈極顯著差異(P<0.01)。NaCl鹽濃度0.20%，0.40%，0.60%時，部分種質(zhì)苗高大于對照，其中0. 40%NaCl處理下12個品種(系)苗高大于對照，‘WL-SALT’比對照增加19.15%，其次為‘中苜3號’和‘游客’，分別增加12.97%和11.73%，其余9個品種(系)增加率都在10%以下，說明低濃度鹽分對苜蓿苗高的促進作用有限；隨著NaCl鹽濃度的升高，0.80%及以上鹽濃度處理下，幼苗苗高顯著低于對照。均值比較表明，除0.40%NaCl鹽濃度下苜蓿種質(zhì)的平均苗高略高于(比對照高1.27%)對照外，整體呈現(xiàn)下降的趨勢，1.40%NaCl鹽濃度下苜蓿種質(zhì)的平均苗高僅為對照的一半，高鹽濃度極大地抑制了幼苗的生長。幼苗生長高的苜蓿耐鹽性較強，排名前5位的分別是‘巨能2’、‘中苜1號’、‘L3003’、‘KRIMA’和‘耐鹽之星’。

表5 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿苗高的影響Table 5 Effects of different NaCl concentration on the seedling height of alfalfa

續(xù)表5

2.1.4苜蓿耐鹽系數(shù)比較及聚類分析 不同苜蓿種質(zhì)發(fā)芽率、苗高、根長和發(fā)芽指數(shù)耐鹽系數(shù)差異明顯，均達極顯著水平(P<0.01)，根長的變化幅度最大為1.30～0.76(表6)。指標的耐鹽系數(shù)大則說明品種(系)的耐鹽性強，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、苗高耐鹽系數(shù)最高的分別是‘4030’，‘巨能2’、‘中苜5號’和‘WL-SALT’，最低的是‘L3003’、‘游客’、‘WL414’和‘SOCA’。

表6 NaCl脅迫下苜蓿發(fā)芽率、苗高、根長、發(fā)芽指數(shù)耐鹽系數(shù)差異Table 6 Differences of salt tolerance coefficient of seed germination rate, seedling height, root length，andgermination index of different alfalfa under NaCl stress

對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、苗高的耐鹽系數(shù)進行標準化處理，以歐氏距離法對23份苜蓿種質(zhì)進行聚類分析，可將其分為3類，第一類為強耐鹽種質(zhì)：包括‘中苜1號’、‘中苜5號’、‘耐鹽之星’、‘WL-SALT’、‘賽迪10’、‘巨能2’、‘巨能801’和‘KRIMA’共8個品種(系)，占34.78%；第二類為中等耐鹽種質(zhì)：包括‘WL414’、‘3010’、‘4030’、‘601FY’、‘Hunter River’、‘皇冠’、‘皇后苜蓿’、‘金皇后’、‘苜蓿王’、‘BISTRA’和‘SOCA’共11個品種(系)，占47.83%；第三類為弱耐鹽種質(zhì)：包括‘中苜3號’、‘游客’、‘L3003’、‘中苜4號’共4個品種(系)，占17.39%。

圖1 苜蓿發(fā)芽率、苗高、根長、發(fā)芽指數(shù)耐鹽系數(shù)聚類圖Fig.1 Dendrogram of different cultivars (strain) based on salt tolerance coefficient of seed germination rate,seedling height, root length and germination index

2.1.51.20%鹽濃度下苜蓿種質(zhì)耐鹽抑制率及聚類分析 方差分析表明(表7)，1.20%NaCl鹽濃

度下，不同種質(zhì)間發(fā)芽率、苗高、根長和發(fā)芽指數(shù)的相對抑制率均呈極顯著差異(P<0.01)，指標的相對抑制率大則說明受到鹽脅迫的抑制作用弱，耐受鹽脅迫的能力強，更加耐鹽。從相對抑制率的值來看，發(fā)芽率的相對抑制率最高的是‘WL414’，最低的是‘中苜4號’；發(fā)芽指數(shù)相對抑制率最高的是‘巨能801’，最低的是‘L3003’；根長相對抑制率最高的是‘中苜3號’，最低的是‘金皇后’；苗高相對抑制率最高的是‘中苜4號’，最低的是‘WL414’。

以發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、苗高的相對抑制率為依據(jù)，聚類分析方法同上，可將其分為3類(圖2)，第一類為強耐鹽種質(zhì)：包括‘中苜1號’、‘中苜5號’、‘耐鹽之星’、‘賽迪10’、‘巨能801’、‘苜蓿王’、‘BISTRA’和‘KRIMA’共8個品種(系)，占34.78%；第二類為中等耐鹽種質(zhì)：包括‘游客’、‘WL414’、‘3010’、‘4030’、‘601FY’、‘Hunter River’、‘皇冠’、‘皇后苜?！?、‘金皇后’、‘L3003’和‘SOCA’共11個品種(系)，占47.83%；第三類為弱耐鹽種質(zhì)：分別是‘中苜3號’、‘WL-SALT’、‘巨能2’和‘中苜4號’共4個品種(系)，占17.39%。

表7 1.20% NaCl脅迫下苜蓿發(fā)芽率、苗高、根長、發(fā)芽指數(shù)相對抑制率差異Table 7 Effects of 1.20% NaCl stress on the inhibition rate of germination rate, seedling height, root length andgermination index of different alfalfa

圖2 1.20% NaCl質(zhì)量分數(shù)下各品種(系)發(fā)芽率、苗高、根長、發(fā)芽指數(shù)抑制率聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of different cultivars(strain)based on germination rate, seedling height, root length，and germination index under 1.20% NaCl stress

2.2 應用隸屬函數(shù)分析法進行耐鹽性綜合評價

不同種質(zhì)受鹽脅迫影響的程度可通過隸屬值反映，隸屬值越大，鹽造成的影響越小，植株的耐鹽能力越強。以發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、苗高和活力指數(shù)為依據(jù)，對23個苜蓿種質(zhì)進行分析，結(jié)果表明(表8)，耐鹽性排在前3位的是‘游客’、‘賽迪10’、‘中苜3號’，‘巨能801’的耐鹽性最弱。

2.3 種子萌發(fā)期耐鹽性評價指標的相關性分析

鹽脅迫對種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、苗高、活力指數(shù)等方面都有較明顯的影響，從這些指標與鹽濃度的相關性分析結(jié)果可以看出，供試苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、苗高與鹽濃度成極顯著負相關；‘中苜3號’根長與鹽濃度成顯著正相關，其余13個品種(系)根長與鹽濃度成顯著至極顯著負相關；除‘中苜1號’、‘中苜3號’和‘巨能2’的活力指數(shù)與鹽濃度相關性不顯著外，其余20個品種(系)活力指數(shù)與鹽濃度成顯著至極顯著負相關(表9)。

表8 NaCl脅迫下各品種(系)隸屬函數(shù)分析Table 8 Membership function analysis of different cultivars(strain) under NaCl stress

表9 苜蓿種子萌發(fā)階段測定指標與鹽濃度的相關性分析Table 9 Correlative analysis between germination index and salt concentration in alfalfa seed germination stage

3 討論與結(jié)論

植物耐鹽性評價是一個較復雜的問題，耐鹽能力的大小是多種代謝的綜合表現(xiàn)[18]。種子的耐鹽性與種子活力關系密切[8]，而種子活力主要決定于遺傳以及種子發(fā)育成熟程度與貯藏期間的環(huán)境因子。遺傳性決定種子活力強度的可能性，發(fā)育程度決定活力程度表現(xiàn)的現(xiàn)實性，貯藏條件則決定種子活力下降的速度。當種子處于最佳成熟時期、最適保存環(huán)境時，種子活力強，相應的耐鹽能力也強。劉大林等[19]研究指出鹽脅迫對種子萌發(fā)活力指數(shù)的影響大于對種子相對發(fā)芽率的影響，這一結(jié)果說明鹽脅迫對苜蓿種子萌發(fā)速度的影響大于對萌發(fā)能力的影響。鹽脅迫對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、苗高等萌發(fā)特性的影響不同，即單項指標在表征耐鹽性中所占的分量不同，同一指標分析相同品種可能得到不同的結(jié)果，因此任一單項指標都不能夠全面評價耐鹽能力。從各指標的相關性分析可以看出，測定的所有指標都存在著不同程度的相關性[20]，必須以多指標、廣角度綜合分析才更具科學性和可靠性。

23份苜蓿種質(zhì)種子萌發(fā)及幼苗耐鹽性研究結(jié)果表明，鹽溶液脅迫下根和苗的生長所受影響有差異。0.40%～0.80%的低鹽濃度對苜蓿根的生長有促進作用，1.00%的較高鹽濃度沒有明顯的促進作用，鹽濃度達1.20%時促進作用完全消失，明顯抑制根的生長；NaCl濃度為0.40%時促進苜蓿苗的生長， 0.60%時則開始抑制苗的生長。韓清芳等[21]、王征宏等[22]認為低鹽濃度促進苜蓿根的生長，本試驗進一步揭示，低鹽濃度促進苜蓿根和苗的生長，尤其在NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.40%時，對二者的促進作用最大，隨著NaCl濃度的增加，促進作用減弱直至產(chǎn)生抑制作用。

種子萌發(fā)的第一步是吸水，鹽濃度決定吸水，低濃度的鹽溶液有調(diào)節(jié)滲透壓、促進種子吸水的作用，最終促進種子萌發(fā)。高鹽濃度時種子吸水不足，不能利用子葉中的儲藏物質(zhì)，呼吸作用受到抑制，種子難以萌發(fā)[23-24]。試驗中測試種子在0.20%，0.40%，0.60% NaCl鹽濃度下部分種質(zhì)的種子發(fā)芽勢高于對照，在0.80%及以上的NaCl處理下，種質(zhì)發(fā)芽勢高于對照的趨勢逐漸減弱，這與馬宗琪等[25]研究結(jié)論一致。NaCl濃度為1.20%和1.40%時，各苜蓿種質(zhì)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長及苗高均達到極顯著差異(P<0.01)，1.20%及以上鹽濃度對于苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用顯著增強，1.20%是苜蓿耐鹽性的轉(zhuǎn)折點，可作為耐鹽鑒定的最佳NaCl濃度。以耐鹽系數(shù)和相對抑制率分別進行聚類分析，兩者的聚類分析結(jié)果中，強、中、弱3類耐鹽品種所占比重無變化，但每個等級中苜蓿品種發(fā)生了變動。

苜蓿萌發(fā)期受不同鹽濃度溶液脅迫，指標之間所表現(xiàn)出的耐鹽性結(jié)果存在差異，綜合發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、苗高、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標，苜蓿耐鹽性由強到弱依次為：巨能2>WL414>巨能801>耐鹽之星>WL-SALT>中苜1號>中苜5號>賽迪10>KRIMA>BISTRA>3010>4030>601FY>Hunter River>SOCA>金皇后>皇后苜蓿>皇冠>苜蓿王>游客>中苜3號>中苜4號>L3003。

對于試驗中出現(xiàn)的矛盾結(jié)果，即同一指標分析相同品種得到的不同結(jié)果，在郭興燕等[26]研究中也存在，對于此結(jié)果產(chǎn)生的原因?qū)⒃诤罄m(xù)的工作中，通過生理生化等指標的測定和研究，進一步分析探討。對23個苜蓿材料種子萌發(fā)特性的研究表明，苜蓿屬植物種子具有一定的耐鹽性，但由于其受遺傳、環(huán)境等因素的影響，不同品種間的耐鹽性存在較大差異。對苜蓿耐鹽性的鑒定和評價應建立在生產(chǎn)實踐的基礎上，選擇科學的，具有普遍性、穩(wěn)定性和適用性的耐鹽性鑒定方法，運用綜合的、全面的評價方法進行鑒定和評價。