王 帥，賈琦珍，張 玲，王連群，陳根元

和田羊睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)與分離鑒定

王 帥，賈琦珍，張 玲，王連群，陳根元*

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

【目的】研究和田羊睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)特性?！痉椒ā咳⌒律吞镅虿G丸組織，利用兩步酶消化后，采用差速貼壁法純化細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并通過形態(tài)學(xué)觀察、HE染色、AKP染色、油紅O染色、吖啶橙染色、羅丹明123染色、免疫組化染色、RTPCR和MTT法檢測細(xì)胞活性及純度?！窘Y(jié)果】培養(yǎng)基中加入2.00%血清濃度的DMEM/F-12可提高支持細(xì)胞純度，在體外培養(yǎng)傳至20代的和田羊睪丸支持細(xì)胞形態(tài)和核型均為正常;所培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)波形蛋白表達(dá)及標(biāo)志基因SCF和GDNF的表達(dá)均為陽性?！窘Y(jié)論】本試驗(yàn)成功建立了和田羊睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。

和田羊;睪丸;支持細(xì)胞;體外培養(yǎng);鑒定

【研究意義】和田羊是新疆南疆地區(qū)和田、阿克蘇等地的主要放牧品種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已被農(nóng)業(yè)部列入《國家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》[1]。和田羊的羊毛具有較好的彈性和光澤度，是本區(qū)維吾爾優(yōu)質(zhì)地毯的主要原料[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前新疆南疆地區(qū)因牲畜數(shù)量增長、過度放牧、缺水等原因，導(dǎo)致本地草甸、草場嚴(yán)重退化，豆科黃芪屬和棘豆屬等瘋草植物大量蔓延。近年來，和田羊因采食瘋草而導(dǎo)致大量中毒，目前已嚴(yán)重影響了南疆地區(qū)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。王帥等[4]研究發(fā)現(xiàn)，和田羊采食瘋草中毒的主要表現(xiàn)為繁殖系統(tǒng)損傷，其中和田羊公羊性欲降低、精子數(shù)量減少、無配種能力，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】睪丸支持細(xì)胞是曲精細(xì)管的組成部分，分布于各期生精細(xì)胞中。支持細(xì)胞是生精上皮中的唯一體細(xì)胞，可分泌必要的營養(yǎng)成分，并作為生精細(xì)胞的支架，起到營養(yǎng)、支持及保護(hù)生精細(xì)胞的作用，使精原細(xì)胞可順利分化為精子[5]。瘋草中毒和田羊臨床表現(xiàn)為精子數(shù)量減少，可能與瘋草毒性物質(zhì)導(dǎo)致的生精細(xì)胞、支持細(xì)胞損傷有關(guān)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以新生24 h雄性和田羊羊羔為研究對象，通過分離其睪丸支持細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，優(yōu)化和田羊睪丸支持細(xì)胞的培養(yǎng)條件，以期得到純度高、活性強(qiáng)的和田羊睪丸支持細(xì)胞，為探討瘋草毒性成分對雄性和田羊繁殖系統(tǒng)損傷的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)新生24 h雄性和田羊羊羔由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供。

DMIL-PH1型倒置相差顯微鏡，DMI4000B型倒置熒光顯微鏡，德國Leica;GELDOC-1T型凝膠成像分析儀，美國UVP;PRO 250型組織勻漿儀，美國Pro Scientific;3110型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo;5480R型高速冷凍離心機(jī)、5331型PCR儀、Realplex2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國Eppendorf。

胰蛋白酶、膠原酶、羅丹明123、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、蘇木精染液、絲裂霉素-C、EDTA、吖啶橙染料、油紅O染料均購自Sigma公司，胎牛血清、DMEM/F12和小牛血清均購自GIBCO公司，試驗(yàn)所用抗體購自Santacruz公司，RNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs和反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自TAKARA寶生物工程(大連)公司，AKP試劑盒購自華美生物工程有限公司。

1.2 新生和田羊睪丸支持細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

參考前人[5-8]研究，75.00%酒精消毒后，于無菌條件下將新生24 h和田羊羊羔斷頭處死，將睪丸組織剝離白膜和血管后，浸于雙抗液+pH 7.20的磷酸緩沖液中浸洗3次，剪碎。把剪碎的組織800 r/min離心2 min后棄上清，依次用10倍體積的0. 15%膠原酶和0.25%胰蛋白酶進(jìn)行兩步法消化，添加少量pH 7.20的磷酸緩沖液800 r/min離心1 min，收集上清，100μm濾網(wǎng)過濾后的細(xì)胞懸液以1000 r/min離心10 min，將細(xì)胞使用含10.00%胎牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞至接種密度，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基DMEM/F12，并除去死亡細(xì)胞，每48 h更換2/3的培養(yǎng)基，之后根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 和田羊睪丸支持細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吸取和田羊睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH 7.20的磷酸緩沖液清洗數(shù)次以去除死亡的睪丸支持細(xì)胞。加入適量0.25%胰蛋白酶液于培養(yǎng)瓶中，鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中出現(xiàn)細(xì)胞突起縮回、間隙增大、近乎縮成圓形時(shí)終止消化，通過吸管吹打脫落和田羊睪丸支持細(xì)胞。然后使用含10.00 %胎牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，接種后在37℃、5 %CO2的條件下培養(yǎng)。每24 h觀察，每48 h更換2/3的培養(yǎng)基。

1.4 和田羊睪丸支持細(xì)胞的鑒定

根據(jù)睪丸支持細(xì)胞的特性，參考Aumuller G[9]、Allard E K[10]和Aponte PM[11]的研究，對培養(yǎng)得到的和田羊睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色(HE染色)、特征性染色(AKP染色、羅丹明123染色、油紅O染色和吖啶橙染色)及免疫組化染色。并參照RNA提取試劑盒說明書提取和田羊睪丸支持細(xì)胞總RNA，將合格RNA利用gDNA Eraser去除基因組DNA，反應(yīng)條件:42℃，2min。然后采用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以檢測支持細(xì)胞標(biāo)志基因SCF和GDNF，反應(yīng)體系為Prime Script?Buffer 5×4.00μl，Prime Script?RT Enzyme MixⅠ1.00μl，RT Primer Mix 1. 00μl，RNA提取液10.00μl，RNase Free dH2O 4.00 μl;反應(yīng)條件:37℃15 min，85℃5 s。引物序列見表1，由TAKARA寶生物工程(大連)公司合成。

1.5 和田羊睪丸支持細(xì)胞的活性測定

將培養(yǎng)的和田羊睪丸支持細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，然后接種于96孔細(xì)胞板中，每2 d更換1/2的細(xì)胞培養(yǎng)液。參考賈琦珍等[3]的研究，于培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7、8天對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。確定培養(yǎng)的和田羊睪丸支持細(xì)胞活性最強(qiáng)的時(shí)間段以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列信息Table1 The nucleotide sequence of primers

圖1 和田羊睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)Fig.1 The culture of testis sertoli cells in Hetian sheep in vitro

1.6 和田羊睪丸支持細(xì)胞染色體的制備

將培養(yǎng)的和田羊睪丸支持細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL濃度后接種于細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.20 mg/L的秋水仙素溶液，孵育4 h后1000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。0.075 mol/L KCl溶液處理，固定液(V(甲醇)∶V(冰乙酸) =3∶1)預(yù)處理3 min，然后正式固定20 min，重復(fù)3次。染色后鏡檢觀察其核型，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 新生和田羊睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)特性

鏡檢發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)過程(圖1)中，新分離的和田羊睪丸支持細(xì)胞為圓形，以均一的單細(xì)胞態(tài)存在;生長試驗(yàn)表明和田羊睪丸支持細(xì)胞貼壁速度快于和田羊睪丸精原細(xì)胞，約0.5 h時(shí)和田羊睪丸支持細(xì)胞即有突起貼壁長出，2 h時(shí)80%以上的和田羊睪丸支持細(xì)胞已貼壁，4 h后可觀察到部分貼壁細(xì)胞具胞體伸展現(xiàn)象。培養(yǎng)24 h后，和田羊睪丸支持細(xì)胞數(shù)量增多、體積變大，細(xì)胞兩側(cè)具多個(gè)突起;培養(yǎng)48 h后，和田羊睪丸支持細(xì)胞基本以單層鋪在瓶底，試驗(yàn)表明培養(yǎng)3～4 d和田羊睪丸支持細(xì)胞即可鋪滿瓶底。新生和田羊睪丸支持細(xì)胞傳代后約2 d即可增殖1代，但傳至6代以后速度明顯減緩，傳代時(shí)間間隔延長，部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，而且細(xì)胞邊緣多呈現(xiàn)為拉絲狀。傳至第20代時(shí)需14～15 d左右才能鋪滿培養(yǎng)皿底壁，而且傳代后的細(xì)胞基本不增殖，部分細(xì)胞死亡并懸浮于培養(yǎng)液中。

圖2 和田羊睪丸支持細(xì)胞的鑒定Fig.2 The identification of testis sertoli cells in Hetian sheep in vitro

圖3 支持細(xì)胞中標(biāo)志基因的表達(dá)檢測Fig.3 Marker gene expression detection of sertoli cells

2.2 新生和田羊睪丸支持細(xì)胞的鑒定

HE染色結(jié)果表明新生和田羊睪丸支持細(xì)胞胞核位于胞質(zhì)中央或偏位，染色較深，而細(xì)胞質(zhì)染色不明顯(圖2-A);AKP染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細(xì)胞不著色，為AKP陰性(圖2-B);油紅O染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細(xì)胞中油滴被染為紅色，細(xì)胞核被染為淡藍(lán)色，并可見雙極小體(圖2-C);吖啶橙染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染為桔紅色，而胞核被染為綠色(圖2-D);羅丹明123染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)在熒光顯微鏡下可見發(fā)綠色熒光的線粒體(圖2-E)。免疫組化結(jié)果表明培養(yǎng)的新生和田羊睪丸支持細(xì)胞內(nèi)波形蛋白表達(dá)明顯(圖2-F)。RTPCR結(jié)果表明培養(yǎng)的新生和田羊睪丸支持細(xì)胞中SCF和GDNF基因均顯著表達(dá)(圖3)。

2.3 新生和田羊睪丸支持細(xì)胞的活性測定結(jié)果

由MTT法檢測(圖4)可知，培養(yǎng)前5 d時(shí)新生和田羊睪丸支持細(xì)胞活性呈上升趨勢，第5天時(shí)其檢測值最高，之后開始下降。表明培養(yǎng)第5天時(shí)的新生和田羊睪丸支持細(xì)胞的活力最強(qiáng)，可用于下一步試驗(yàn)。

圖4 MTT法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間睪丸支持細(xì)胞的活性Fig.4 The viabilitymeasurement of testis sertoli cells at various culturing time by MTT assay

圖5 和田羊睪丸支持細(xì)胞核型分析Fig.5 The karyotype analysis of testis sertoli cells in Hetian sheep

2.4 新生和田羊睪丸支持細(xì)胞染色體核型分析

如圖5所示，體外培養(yǎng)至第5天的新生和田羊睪丸支持細(xì)胞內(nèi)均含有正常的二倍體核型，計(jì)數(shù)可得新生和田羊睪丸支持細(xì)胞中共有42條染色體。

3 討 論

支持細(xì)胞是動(dòng)物睪丸曲精上皮中唯一的體細(xì)胞，可通過分泌多種蛋白質(zhì)，促進(jìn)局部免疫豁免而參與精子的發(fā)生過程。睪丸支持細(xì)胞不僅為精子的發(fā)生提供有利的微環(huán)境，還可清除凋亡的精子細(xì)胞，優(yōu)化精子質(zhì)量，目前已被廣泛應(yīng)用于繁殖細(xì)胞發(fā)育研究。胚胎動(dòng)物具有細(xì)胞分化程度低、體外生存能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，使用新生動(dòng)物體外培養(yǎng)可獲得高活率的睪丸組織細(xì)胞。蛋白酶消化法因其對細(xì)胞的損害程度較輕，已成為國內(nèi)外學(xué)者[6，12]采用較多的方法。本試驗(yàn)采用兩步酶消化法，先用膠原酶去除曲精細(xì)管間的間質(zhì)細(xì)胞和管周細(xì)胞，然后再用胰蛋白酶釋放出曲精細(xì)管中的支持細(xì)胞。結(jié)果表明，該方法獲得的睪丸支持細(xì)胞純度較高。與Bucci等[12]和張學(xué)明等[13]的研究相比，本試驗(yàn)以短時(shí)間的胰蛋白酶消化取代透明質(zhì)酸酶和脫氧核糖核酸酶作用，既避免了長時(shí)間的酶作用對細(xì)胞的損傷，又得到了較好的分離效果，說明胰蛋白酶的選擇和兩步酶消化法的確定有利于新生和田羊睪丸組織的消化分離。

研究表明，睪丸管周細(xì)胞為AKP染色陽性，而睪丸支持細(xì)胞為AKP染色陰性;油紅O染色可用來鑒定細(xì)胞中是否含有油滴，而雙極小體和油滴是睪丸支持細(xì)胞所特有;吖啶橙染色顯示細(xì)胞質(zhì)被染成桔紅色，細(xì)胞核被染成綠色，與睪丸支持細(xì)胞中胞質(zhì)富含RNA，胞核富含DNA的特性一致;羅丹明123可對睪丸支持細(xì)胞中富含的線粒體膜電位進(jìn)行染色鑒定;波形蛋白可用于區(qū)分精原干細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞，GDNF和SCF均為鑒定睪丸支持細(xì)胞的特征性基因。本試驗(yàn)通過對新生和田羊睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)，并利用形態(tài)學(xué)方法、相關(guān)染色、免疫組化染色及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了相應(yīng)的鑒定。結(jié)果表明，本試驗(yàn)獲得了純度較高的睪丸支持細(xì)胞。MTT法具有成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的常用分析方法[3，14]。本研究結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的新生和田羊睪丸支持細(xì)胞在前5 d為活性上升期，第5天活性最強(qiáng);核型分析表明培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞具有正常的二倍體構(gòu)型，即本試驗(yàn)成功培養(yǎng)出活性正常的和田羊睪丸支持細(xì)胞，培養(yǎng)第5天的細(xì)胞可用于外源毒性物質(zhì)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的影響研究。

血清是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中重要的組成部分，可為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營養(yǎng)成分，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長;又可通過內(nèi)含的生長調(diào)節(jié)因子與激素抑制細(xì)胞的過速生長，從而對細(xì)胞生長的過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，含有2.00%濃度血清的細(xì)胞培養(yǎng)基可促進(jìn)新生和田羊睪丸支持細(xì)胞的體外生長速率，該研究結(jié)果對和田羊睪丸支持細(xì)胞的馴化和篩選均具有一定的研究意義。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用膠原酶和胰蛋白酶進(jìn)行兩步法消化新生和田羊睪丸組織，然后采用差速貼壁法純化細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。鏡檢及染色結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入2%血清濃度的DMEM/F-12可提高支持細(xì)胞純度，在體外培養(yǎng)傳至20代的和田羊睪丸支持細(xì)胞形態(tài)和核型均為正常，所培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)波形蛋白表達(dá)及標(biāo)志基因SCF和GDNF的表達(dá)均為陽性，MTT法測定第5天時(shí)細(xì)胞活性最強(qiáng)。通過試驗(yàn)建立了穩(wěn)定的和田羊睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。

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(責(zé)任編輯 李山云)

Culture and Identification of Testis Sertoli Cells in Hetian Sheep in vitro

WANG Shuai，JIA Qi-zhen，ZHANG Ling，WANG Lian-qun，CHEN Gen-yuan*
(College of Animal Science，Tarim University/Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology，XinJiang Production& Construction Corps，Xinjiang Alar 843300，China)

【Objective】The aim of this study was to explore the cultural characteristics of testis sertoli cells in Hetian sheep in vitro.【Method】The experimental testis sertoli cellswere obtained from Hetian sheep lamb in 24 h by two-step enzymatic digestion，then the adhesion method was used to purify testis sertoli cells.To observe the testis sertoli cells growth and purity withmorphologicmethod，HE staining detection，AKP staining detection，ORO staining detection，acridine orange staining detection，rhodamine123 staining detection，immunohistochemical staining detection，RT-PCR，cell counting MTT assay.【Result】The results showed that2.00%fetal bovine serum in DMEM/ F-12 medium could be good to culture testis sertoli cells in vitro，the sertoli cells which obtained from Hetian sheep lamb in 24 h could be passaged to 20th generation，the testis sertolicells contained normal cellmorphous and diploid karyotype，the testis sertoli cells expressed vimentin by immunohistochemical staining，RT-PCR result indicated that the SCF gene and GDNF gene expressed in testis sertoli cells.【Conclusion】These results demonstrated thatwe successed to establish themodle of testis sertoli cells in Hetian sheep.

Hetian sheep;Testis;Sertoli cell;Culture in vitro;Identification

S823.3

A

1001-4829(2017)8-1918-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.039

2016-10-02

國家自然科學(xué)基金(31460678);國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA891015);兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(HS201409)

王 帥(1984-)，男，山西長治人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事動(dòng)物中毒病及毒理學(xué)方面的研究，E-mail:wangshuaidky@126.com，*為通訊作者。