吳松成，朱麗莉，唐繼高，伍革民

荔波瑤山雞TGFβ3基因多態(tài)性與繁殖性狀的相關(guān)性

吳松成，朱麗莉，唐繼高，伍革民*

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005)

【目的】為探明荔波瑤山雞TGFβ3基因與繁殖性狀的關(guān)系，尋找可作為雞繁殖性狀的遺傳標(biāo)記?！痉椒ā酷槍?duì)TGFβ3基因設(shè)計(jì)6對(duì)引物，采用PCR測(cè)序法篩選多態(tài)位點(diǎn)，并利用荔波瑤山雞母系60個(gè)個(gè)體進(jìn)行繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析。【結(jié)果】荔波瑤山雞TGFβ3基因有17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)和1755(A→G)位點(diǎn)各300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔和300日齡就巢次數(shù)間呈顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01);3343(C→T)與首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔和300日齡就巢次數(shù)均呈顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01);3540(C→T)與開產(chǎn)日齡、300日齡產(chǎn)蛋量和首次就巢持續(xù)時(shí)間均呈顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01);4786(C→T)和7471(G→A)分別與300日齡產(chǎn)蛋量和首次就巢日齡均呈顯著相關(guān)(P＜0.05);7263(C→T)與首次就巢持續(xù)時(shí)間呈顯著相關(guān)(P＜0.05)。【結(jié)論】TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786(C→T)、7263(C→T)和7471(G→A)與就巢性狀關(guān)聯(lián)顯著，可作為降低就巢性提高繁殖力的輔助選擇標(biāo)記。

TGFβ3基因;基因多態(tài)位點(diǎn);荔波瑤山雞;繁殖性狀

【研究意義】荔波瑤山雞是貴州省的優(yōu)良地方雞品種資源之一，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩等特點(diǎn)，但因開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋量、就巢性等重要經(jīng)濟(jì)性能偏低限制其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[1]。因此，篩選影響荔波瑤山雞高繁殖力的主效候選基因，闡明其繁殖性狀的控制調(diào)節(jié)機(jī)理，對(duì)荔波瑤山雞優(yōu)良種質(zhì)資源的保護(hù)及利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TGFβ(transforming growth factor-β，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)是TGFβ超家族成員之一，是一種二聚體多肽，相對(duì)分子量為25 kDa的蛋白，最初以無活性的前體蛋白形式合成，主要通過獨(dú)特的轉(zhuǎn)膜Ser/Thr激酶受體實(shí)施生物學(xué)應(yīng)答[2]。研究表明，TGFβ存在于大多數(shù)正常細(xì)胞及組織中，廣泛參與細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、血管生成、纖維化、細(xì)胞凋亡及機(jī)體免疫系統(tǒng)等生理過程[3]。目前共發(fā)現(xiàn)5種TGFβ異構(gòu)體，在哺乳動(dòng)物中己鑒定出3種，分別為TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，位于不同的染色體上，但其生物學(xué)作用相似，且在氨基酸序列上具有極高的同源性，均含有7個(gè)外顯子[4]。TGFβ1在卵巢組織中高表達(dá)，與卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖、分化和排卵有關(guān)[5];大白豬的TGF-β1基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)間顯著關(guān)聯(lián)(P＜0. 05)[6]。TGFβ2位于卵泡膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中抑制素和活化素的產(chǎn)生[7];在豬顆粒細(xì)胞中TGFβ2會(huì)抑制FSH誘導(dǎo)的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄激活[8]。TGFβ3在牛卵泡的顆粒細(xì)胞以及膜細(xì)胞中，TGFβ3mRNA的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于TGFβ1和TGFβ2[9];TGFβ3基因在湖羊的生殖器官表達(dá)相對(duì)較高，在高產(chǎn)組與低產(chǎn)組間差異極顯著(P＜0.01)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以上研究結(jié)果表明，TGFβ3在動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育過程中有十分重要的調(diào)控作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用PCR測(cè)序法篩選多態(tài)位點(diǎn)，并分析TGFβ3基因多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，尋找TGFβ3基因的多態(tài)位點(diǎn)作為繁殖性狀遺傳標(biāo)記的可行性，以期為荔波瑤山雞的選擇性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)雞群選自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場(chǎng)的荔波瑤山雞母雞，60只，群體一致性較好，性能較為穩(wěn)定，采用常規(guī)飼養(yǎng)管理方式個(gè)體籠養(yǎng)。翅下靜脈采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存，用于提取基因組DNA。

1.2 性狀測(cè)定

120日齡母雞轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍單個(gè)籠養(yǎng)至300日齡，逐個(gè)測(cè)定開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重、就巢性等繁殖性狀，測(cè)定方法按照NY/T 823-2004[11]進(jìn)行。

1.3 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中的DNA。根據(jù)GenBank中雞的TGFβ3基因序列(登錄號(hào):NC-006092.3)，由天根生化科技有限公司合成6對(duì)引物(表1)檢測(cè)TGFβ3基因在荔波瑤山雞60個(gè)個(gè)體中的基因型遺傳變異情況。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR反應(yīng)體系20μl:DNA模板1μl，上下游引物各1μl，2×Taq PCR MasterMix試劑10μl，加ddH2O至20μl。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性6 min;95℃變性30 s，特定溫度(各引物的退火溫度)退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托諾賽基因組研究中心有限公司純化回收后進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，進(jìn)入基因庫網(wǎng)站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼變異情況，利用Spss18.0軟件采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關(guān)性。

表1 用于荔波瑤山雞TGFB3基因型檢測(cè)的引物信息Table 1 Primers used in detection of TGFβ3genotype in Liboyaoshan Chicken

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)位點(diǎn)及遺傳多態(tài)性

從表2可知，6對(duì)引物在荔波瑤山雞TGFB3基因中共檢測(cè)出17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中引物1檢測(cè)出2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均位于外顯子1上;引物2檢測(cè)出2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別位于外顯子2和內(nèi)含子2上;引物3檢測(cè)出5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均位于內(nèi)含子3上;引物4檢測(cè)出1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，位于外顯子4上;引物5檢測(cè)出4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，1個(gè)位于外顯子5上，3個(gè)位于內(nèi)含子5上;引物6檢測(cè)出3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，2個(gè)位于外顯子6上，1個(gè)位于內(nèi)含子5上。TGFβ3基因17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的多肽信息含量在0.06～0.38。

表2 荔波瑤山雞TGFB3基因的多態(tài)位點(diǎn)及其遺傳多態(tài)性Table 2 Polymorphic sites and genetic polymorphism of TGFβ3 gene in Liboyaoshan Chicken

表3 荔波瑤山雞TGFB3基因多態(tài)位點(diǎn)與不同繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性Table 3 TGFβ3 gene polymorphic sites and their correlations related to different production traits in Liboyaoshan Chicken

2.2 17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

TGFβ3基因的17個(gè)突變位點(diǎn)分別位于外顯子1的53(T→C)和140(T→C)，外顯子2的1653(C→T)，內(nèi)含子2的1755(A→G)，內(nèi)含子3的3343 (C→T)、3428(T→C)、3464(A→T)、3525(A→T)和3540(C→T)，外顯子4的4183(C→T)，外顯子5的4786(C→T)，內(nèi)含子5的5019(A→G)、5039(C→T)、5066(C→T)和7214(A→G)，外顯子6的7214 (A→G)、7263(C→T)和7471(G→A)。經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，外顯子1上53(T→C)，外顯子2上的1653(C→T)，內(nèi)含子2上1755(A→G)，內(nèi)含子3上3343(C→T)和3540(C→T)，外顯子5上4786(C→T)，外顯子6上7263(C→T)和7471(G→A)位點(diǎn)分別與不同繁殖性狀存在顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01)，其余9個(gè)突變位點(diǎn)與荔波瑤山雞的繁殖性狀關(guān)聯(lián)不顯著(表3)。

2.3 8個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性

從表4可知，TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786 (C→T)、7236(C→T)和7471(G→A)8個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性。其中，53(T→C)位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)第135位天冬酰胺發(fā)生同義突變[N( AUU→ACC)]。位點(diǎn)53變異將基因型分為TC、TT和CC，TT型的開產(chǎn)日齡分別比CC型和TC型晚23.17和19.85 d。CC型的300日齡產(chǎn)蛋量分別比TC型和CC型多49.95和54.17枚。CC型的首次就巢日齡比TC型推遲104.36 d，比TT型推遲85. 48 d。CC型的首次就巢持續(xù)時(shí)間比TT型和TC型短15.25和12.52 d;首次就巢至重新開產(chǎn)間隔時(shí)間比TT型和TC型短6.06和8.42 d;300日齡就巢次數(shù)比TT型和TC型少2.06和2.51次。

1653(C→T)位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)第209位精氨酸發(fā)生同義突變[R(CGC→CGT)]，CT型的300日齡產(chǎn)蛋量分別比CC型少61.43枚，比TT型少34.43枚;試驗(yàn)期間CC型個(gè)體母雞未表現(xiàn)出就巢行為，因此CC型的首次就巢日齡、首次就巢日齡持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔時(shí)間、300日齡就巢次數(shù)均與CT型和TT型呈極顯著差異。1755(A→G)位點(diǎn)GG型的300日齡產(chǎn)蛋量分別比AG型和AA型多59.92和43.27枚;首次就巢日齡分別比AG型和AA型晚152.50和106.11 d;首次就巢至重新開產(chǎn)間隔分別比AG型和AA型早7.15和7. 19 d;300日齡就巢次數(shù)分別比AG型和AA型少2. 22和2.02次。3343(C→T)位點(diǎn)C型的首次就巢持續(xù)時(shí)間分別比CT型和TT型短9.16和10.14 d;首次就巢至重新開產(chǎn)間隔分別比CT型和TT型短5.86和5.93 d;300日齡就巢次數(shù)分別比CT型和TT型少1.54和1.92次。3540(C→T)位點(diǎn)TT型的開產(chǎn)日齡分別比CT型和CC型晚18.5和30.66 d;300日齡產(chǎn)蛋量分比CT型和CC型少27.77和 24.77枚;首次就巢持續(xù)時(shí)間比CC型長(zhǎng)15.78 d。4786(C→T)位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)第322位異亮氨酸發(fā)生同義突變[I(AUU→AUC)];CC型的300日齡產(chǎn)蛋量分比CT型和TT型少56.47和46.75枚;

首次就巢日齡分別比CT型和TT型晚82.17和57. 33 d。7263(C→T)位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)第322位脯氨酸發(fā)生同義突變〔P(CCC→CCU)〕，CT型的首次就巢持續(xù)時(shí)間比TT型長(zhǎng)11.53 d。7471(G→A)位點(diǎn)AA型的300日齡產(chǎn)蛋量分比GG型和GA型少58.00和54.07枚;首次就巢日齡分別比GG型和GA型晚87.09和71.67 d。

表4 荔波瑤山雞TGFB3基因8個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與不同繁殖性狀的相關(guān)性Table 4 Correlations between 8 relevant sites of TGFB3 gene and different production traits in Liboyaoshan Chicken

3 討 論

目前，對(duì)雞TGFβ3基因的研究主要在雞的肌肉脂肪沉積、肝臟代謝和雞蛋殼強(qiáng)度的相關(guān)性方面，如TGFβ3基因?qū)ξ牟u蛋殼強(qiáng)度有顯著影響(加性作用)，T2T2基因型個(gè)體比T1T1基因型的蛋殼強(qiáng)度值高15.45%(P＜0.05)，比T1T2基因型高12.50 %(P＜0.05);TGFβ3基因?qū)Φ皻?qiáng)度以加性方式作用，其加性效應(yīng)值為0.209(P＜0.05)[12]。TGF β3與Wnt-10α和Catenin-β等細(xì)胞外信號(hào)因子，協(xié)同調(diào)控IMF在矮小型雞肌肉組織中沉積的信號(hào)通路中發(fā)揮了重要作用[13]。通過雞細(xì)胞系過表達(dá)miR-122證明其對(duì)TGFβ3的調(diào)控在mRNA水平，表明miR-122可能通過調(diào)控TGF-β3基因在雞肝臟代謝中發(fā)揮調(diào)控作用[14]。目前，尚未見TGFβ3基因核苷酸變異與雞就巢性、產(chǎn)蛋量等繁殖性狀的相關(guān)性報(bào)道。研究表明，荔波瑤山雞TGFB3基因上53 (T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3540(C→T)、4786(C→T)和7471(G→A)6個(gè)SNP變異位點(diǎn)不同基因型間的300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢持續(xù)時(shí)間存在顯著或極顯著相關(guān)，該基因可作為繁殖性狀標(biāo)記輔助選育的候選基因。

4 結(jié) 論

荔波瑤山雞TGFβ3基因有17個(gè)SNP，其中53 (T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786(C→T)、7263(C→T)和7471(G→A)8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與荔波瑤山雞繁殖性狀存在顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01);外顯子1、外顯子2、外顯子5和外顯子6上各自存在1個(gè)SNP位點(diǎn)引起相應(yīng)編碼氨基酸種類的改變。荔波瑤山雞TGFβ3基因的多態(tài)性與產(chǎn)蛋量呈顯著或極顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01)，該基因可能是影響其產(chǎn)蛋量的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標(biāo)記基因，可作為繁殖性狀標(biāo)記輔助選育的候選基因。

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(責(zé)任編輯 馮 衛(wèi))

TGFβ3 Gene Polymorphism and Correlations between TGFβ3 Gene and Reproduction Traits in Liboyaoshan Chicken

WU Song-cheng，ZHU Li-li，TANG Ji-gao，WU Ge-min*
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary in Guizhou Academy of Agricultural Science，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】This study aimed to explore the correlations between TGFβ3 gene and reproduction traits in Liboyaoshan Chicken and seek geneticmarketsof chicken reproduction trait.【Method】The correlationsbetween TGFβ3 gene and reproduction traitsare determined by analyzing 60 Liboyaoshan hens based on PCR technology.【Result】There are17 polymorphic sites in TGFβ3 gene of Liboyaoshan Chicken. 53(T→C)，1653(C→T)and 1755(A→G)sites are related to total egg number from 120 to 300 d age(EN300)，age at first broodiness behavior(AFBB)，duration of age at first broodiness behavior(DAFBB)，interval of age at first broodiness behavior between anew laying (IAFBBA)and times of broodiness behavior from 120 to300 d of age(TBB300)significantly or very significantly.3343(C→T)site is related to AFBB，IAFBBA and TBB300 significantly or very significantly.3540(C→T)site is related to AFE，EN300 and DAFBB significantly or very significantly.4786(C→T)and 7471(G→A)site is significantly related to EN300 and DAFBB respectively.7263(C→T) site is related to DAFBB significantly.【Conclusion】53(T→C)，1653(C→T)，1755(A→G)，3343(C→T)，3540(C→T)，4786(C→T)，7263(C→T)and 7471(G→A)sites of TGFβ3 gene are significantly related to reproduction traits，which indicates that these polymorphic sites can be used as assistant selection markers for improvement of reproductive capacity of Liboyaoshan Chicken.

TGFβ3 gene;Polymorphic site;Liboyaoshan Chicken;Reproduction trait

S831

A

1001-4829(2017)8-1823-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.040

2016-11-29

貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目“瑤山雞ONECUT1基因的CDS區(qū)克隆、差異表達(dá)及與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析”[黔科合LH字(2015)7067];貴州省基金項(xiàng)目“瑤山雞就巢性選育關(guān)鍵基因篩選”[黔科合J字(2014)2102];貴州省農(nóng)業(yè)動(dòng)植物育種項(xiàng)目“瑤山雞新品系選育”[黔農(nóng)育專字(2014)008];貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2014年博士基金項(xiàng)目“瑤山雞STAT5基因變異檢測(cè)及與產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析”

吳松成(1966-)，男，貴州荔波人，學(xué)士，助理研究員，從事家禽遺傳育種與養(yǎng)殖技術(shù)研究，E-mail:13885151440@ 163.com，Tel:13885151440，*為通訊作者:伍革民，E-mail:wgmabcdef@163.com。