梅京京，韓海鋒，王龍飛，張丹，吳庭才，李小康

（1.漯河市畜牧直屬分局，河南漯河462000，2.漯河市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，3.河南科技大學(xué)）

一株大腸桿菌的分離與鑒定

梅京京1，韓海鋒2，王龍飛1，張丹1，吳庭才3*，李小康3

（1.漯河市畜牧直屬分局，河南漯河462000，2.漯河市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，3.河南科技大學(xué)）

選取洛陽自然保護(hù)區(qū)野生成年白鷺，通過無菌采取其口腔拭子和肛門拭子進(jìn)行細(xì)菌的增殖，得到3株分離菌，再對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定及藥敏試驗(yàn)。分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上形成邊緣整齊表面光滑濕潤(rùn)的紅色菌落，革蘭氏染色呈陰性。分離菌使甘露醇、鼠李糖、甘油、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖發(fā)酵變?yōu)辄S色；該菌具有明膠酶，使明膠水解生成多肽再水解為氨基酸，使明膠液化。吲哚試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)；V-P試驗(yàn)為陰性；MR試驗(yàn)為陽性。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)青霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、鏈霉素5種藥物均為高度敏感。

野生禽類；大腸桿菌；分離；生化鑒定；藥敏試驗(yàn)

大腸桿菌病是由大腸桿菌埃希氏菌的某些致病菌引起的疾病總稱，常引起禽類局部或全身性感染如心肌炎、肝周炎、氣囊炎、敗血癥、臍帶炎、眼炎和卵黃性腹膜炎等。目前，禽源大腸桿菌的研究資料絕大多數(shù)來源于家禽。有關(guān)野生禽源大腸桿菌的系統(tǒng)性研究相對(duì)較少。但隨著集約化養(yǎng)殖的急劇發(fā)展和環(huán)境污染的加劇，野生禽類也頻發(fā)此病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和野生禽類的保護(hù)影響甚大。選取洛陽自然保護(hù)區(qū)野生成年白鷺進(jìn)行試驗(yàn)研究，旨在為野生禽類大腸桿菌病的防治和野生動(dòng)物的保護(hù)提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 病料

洛陽自然保護(hù)區(qū)管理處提供的野生成年白鷺的口腔黏液和糞便。

1.2 器材與試劑

超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、糖發(fā)酵（分解）試驗(yàn)試劑及指示劑、V-P試驗(yàn)試劑、甲基紅（MR）試驗(yàn)試劑、吲哚試驗(yàn)試劑、革蘭氏染色液、蛋白胨、牛肉膏等。

1.3 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

無菌采取疑似病例的糞便和口腔黏液，加入適量生理鹽水，在無菌操作臺(tái)中用接種環(huán)接種于麥康凱瓊脂平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15 h進(jìn)行培養(yǎng)與分離。

1.4 細(xì)菌增殖

無菌操作，將麥康凱培養(yǎng)基中的紅色單一菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)7～8 h。觀察生長(zhǎng)狀況，放置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 革蘭氏染色

無菌操作，用接種環(huán)LB液體培養(yǎng)基中的菌液，涂于載玻片上，用酒精燈固定；在已干燥、固定好的玻片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1～2 min水洗；加革蘭氏碘液與抹片上媒染，經(jīng)1～3 min，水洗；加95%酒精與抹片上脫色，約1 min，水洗；加10倍稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1～2 min，水洗；吸干或烘干，用100倍的油鏡進(jìn)行菌體形態(tài)和染色特性的觀察；革蘭氏陽性細(xì)菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性細(xì)菌呈紅色［1］。

1.6 生化鑒定

制備生化試驗(yàn)培養(yǎng)基，將分離純化過的待檢菌分別進(jìn)行糖類發(fā)酵試驗(yàn)即生化反應(yīng)，主要包括蔗糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)及MR試驗(yàn)。用挑菌環(huán)挑取菌液并溶于各生化管中，根據(jù)條件的不同放置不同設(shè)定的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h或48 h后觀察。

1.7 藥敏試驗(yàn)

該試驗(yàn)所用方法為CLSI推薦的K-B法進(jìn)行，將分離純化鑒定過的待檢菌在血清肉湯培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)12 h，然后用微量移液器取20 μl菌液于LB培養(yǎng)皿中，用L棒涂抹均勻，貼上藥敏片，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15～24 h，再用直尺測(cè)量其抑菌環(huán)的直徑，判斷標(biāo)準(zhǔn)參考NCCLS藥敏紙片擴(kuò)散法。抑菌圈直徑＞15 mm為高度敏感；在10～15 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感［2］。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

病原菌在麥康凱瓊脂平板上形成的菌落邊緣整齊或波形，稍凸起，表面光滑濕潤(rùn)，直徑大約2.0 mm，呈紅色，因待檢菌發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸，使中性紅指示劑變紅色，長(zhǎng)出紅色菌落。在普通的LB培養(yǎng)基上，則長(zhǎng)出表面光滑無色半透明菌落。

2.2 革蘭氏染色

在油鏡下觀察革蘭氏染色結(jié)果為紅色短桿菌，無芽孢和莢膜，單獨(dú)和成對(duì)存在。

2.3 生化鑒定

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：細(xì)菌使甘露醇發(fā)酵變?yōu)辄S色；使鼠李糖、甘油、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖發(fā)酵變?yōu)辄S色；該菌具有明膠酶，使明膠水解生成多肽再水解為氨基酸，使明膠液化。該菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑時(shí)，形成紅色的玫瑰吲哚。該菌在分解葡萄糖過程可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使甲基紅指示劑變紅。該菌的生化試驗(yàn)結(jié)果與大腸桿菌的特征基本一致，見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果匯總見表2。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

該試驗(yàn)通過革蘭氏染色確定該分離菌為革蘭氏陰性短桿菌，且能在LB培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，并出現(xiàn)與大腸桿菌一致的生長(zhǎng)特征。2010年劉華等人對(duì)一株孔雀源大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，該株孔雀源大腸桿菌的鏡檢結(jié)果為兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性短桿菌；該菌株的培養(yǎng)特性為在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小，表面光滑濕潤(rùn)的粉紅色菌落［3］。其相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果與該次試驗(yàn)結(jié)果相一致。2013年李雙雙等人對(duì)兔源大腸桿菌進(jìn)行鑒定，該菌鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性，兩端鈍圓，呈單個(gè)或多個(gè)散在排列；該菌在普通培養(yǎng)基上形成表面光滑、邊緣整齊、濕潤(rùn)半透明的灰白色圓形突起菌落，在麥康凱瓊脂平板上形成紅色、中等大小、表面光滑、濕潤(rùn)的單個(gè)菌落［4］。因此，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和培養(yǎng)特性的研究，可初步確定該分離株為大腸桿菌。

該試驗(yàn)除采用常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法外，還進(jìn)行了一系列生化鑒定試驗(yàn)以便對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，鑒定試驗(yàn)結(jié)果為該分離株能利用鼠李糖、甘油、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖及棉籽糖；V-P試驗(yàn)陰性，MR試驗(yàn)為陽性，吲哚試驗(yàn)陰性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第八版》標(biāo)準(zhǔn)及《腸桿菌科生化鑒定編碼手冊(cè)》，此生化鑒定結(jié)果表明該分離株的生化特性與大腸桿菌的生化特性相一致。2015年孫蓉蓉等人對(duì)水貂大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，其生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果為分離菌均可分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大部分菌株還可利用蔗糖；VP試驗(yàn)陰性，MR試驗(yàn)為陽性，吲哚試驗(yàn)陰性［5］，與該次試驗(yàn)結(jié)果相一致。2013年達(dá)娃次仁等人對(duì)西藏牦牛源大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，其生化鑒定結(jié)果為分離菌能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖和麥芽糖；MR試驗(yàn)陽性，V-P試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陽性［6］，與該次試驗(yàn)結(jié)果相一致。至此可基本確定該分離菌為大腸桿菌。

該研究還對(duì)待檢菌進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，該分離菌對(duì)青霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、鏈霉素5種藥物均為高度敏感。說明該分離株對(duì)這幾種抗生素的耐藥性都比較低，可能是由于該野禽生存和活動(dòng)的環(huán)境抗生素污染并不嚴(yán)重。該次的藥敏試驗(yàn)結(jié)果可為維護(hù)公共衛(wèi)生安全提供幫助，也可為該保護(hù)區(qū)野生禽類大腸桿菌病的防治提供依據(jù)。

［1］郭伶，代竹青.一例雞大腸桿菌的分離與鑒定［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（1）：184-185.

［2］胡仕鳳，雷紅宇，寧玲忠，等.雞大腸桿菌病的診斷與防治［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2005，（5）：15.

［3］劉華，祁克宗，朱良強(qiáng)，等.一株孔雀源大腸桿菌分離鑒定與致病特性初步研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16（9）：27-29.

［4］李雙雙，賀志沛，羅俊娜，等.兔源大腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性檢測(cè)研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（8）：70-72.

［5］孫蓉蓉，鄒玲，劉文華，等.水貂大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：125-126.

［6］達(dá)娃次仁，格桑卓瑪，貢嘎，等.牦牛源大腸桿菌西藏分離株的血清型鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013，62（21）：160-161.

S852.61+2

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1004-5090（2017）08-0010-02

2017-06-25）