丁美玉 亓 超 姜相君*大連醫(yī)科大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科(660) 普外科

胃癌組織中Nupr1的表達(dá)及其臨床意義

丁美玉1亓 超2姜相君1*
大連醫(yī)科大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科1(266011) 普外科2

背景：胃癌的發(fā)病率和死亡率在全球居高不下，因此亟需探索胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。核蛋白1(Nupr1)具有多種生物學(xué)功能，尤其是在惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程中的作用突出。目的：探討Nupr1在胃癌中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)72例胃癌組織及其配對(duì)癌旁組織中的Nupr1 mRNA表達(dá)，以蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化技術(shù)檢測(cè)Nupr1蛋白表達(dá)及其細(xì)胞定位，分析Nupr1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：胃癌組織中Nupr1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織(P<0.05)，兩者表達(dá)變化趨勢(shì)相一致。Nupr1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核內(nèi)也可見少量表達(dá)。胃癌組織中的Nupr1 mRNA表達(dá)與腫瘤體積、分化程度、病理類型、Bormann分型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：Nupr1在胃癌組織中高表達(dá)并可能與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展相關(guān)，可作為胃癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的新標(biāo)記物，并可能成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

胃腫瘤； 疾病惡化； 核蛋白類； 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)； 印跡法，蛋白質(zhì)； 免疫組織化學(xué)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，位列全球惡性腫瘤發(fā)病率的第4位，在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率分別居于第2位和第3位[1-2]。目前胃癌的有效治療手段有限，單純手術(shù)治療的總體生存率只有20%左右，放療和化療亦無明顯生存優(yōu)勢(shì)[3]。因此，亟需探索診斷和治療胃癌的新技術(shù)和新靶點(diǎn)。

核蛋白1(nuclear protein 1, Nupr1)又稱p8或com1(candidate of metastasis-1)，具有核定位信號(hào)序列(nuclear localization sequence, NLS)，是一種腫瘤相關(guān)應(yīng)激分子，最先是從急性胰腺炎大鼠的胰腺腺泡細(xì)胞中被克隆證實(shí)并命名[4-6]。Nupr1具有轉(zhuǎn)錄活性，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[7]，但有關(guān)其在胃癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制的研究鮮見。本研究旨在探討Nupr1在胃癌中的表達(dá)情況及其臨床意義，以期為胃癌的臨床診治提供新思路。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

收集2015年7月—2016年6月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院普外科手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本(癌灶中央非壞死區(qū)域)72例及其配對(duì)癌旁組織標(biāo)本(距癌組織邊緣5 cm以上)72例，標(biāo)本取下后立即置于RNA保存液中，-80 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有癌組織標(biāo)本均經(jīng)2名資深病理科醫(yī)師確診為原發(fā)性胃癌。標(biāo)本來源病例中男性56例，女性16例，年齡43～89歲，平均年齡(61.11±10.16)歲，中位年齡60歲；術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療，術(shù)中均行淋巴結(jié)清掃，臨床資料完整。研究方案經(jīng)青島醫(yī)學(xué)會(huì)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本使用取得患者知情同意。

二、方法

1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Nupr1 mRNA表達(dá)：將胃癌和癌旁組織充分研磨后，以總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]合成cDNA，以之為模板行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，Nupr1引物序列：F 5’-GAC AGA CAA AGC GTT AGG AGA A-3’，R 5’-GGA GTC AGA GGT GAA GTG GG-3’；β-actin(內(nèi)參)引物序列：F 5’-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3’，R 5’-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3’。反應(yīng)體系含cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、SYBR GREEN Master Mix 10 μL(北京索萊寶科技有限公司)，以雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每一樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Nupr1蛋白表達(dá)：以RIPA裂解液和PMSF裂解、抽提胃癌和癌旁組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘樱?jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入兔抗人Nupr1一抗(Abcam plc.，1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光試劑自顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以Gel-Pro Analyzer軟件分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶光密度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3. 免疫組化染色檢測(cè)Nupr1蛋白表達(dá)及其細(xì)胞定位：胃癌和癌旁組織病理蠟塊4 μm連續(xù)切片，使用SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)行免疫組化染色。病理切片常規(guī)脫蠟、水化，高壓抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加Nupr1一抗(Proteintech Group，1∶150)，37 ℃孵育3 h，PBS洗滌后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌后DAB染色，自來水沖洗終止染色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

結(jié)果判定：在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中觀察到淡黃色至黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞。于200倍視野下隨機(jī)觀察至少5個(gè)視野，采用半定量積分法進(jìn)行免疫組化評(píng)分，總分為染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞率評(píng)分之積。染色強(qiáng)度評(píng)分：未染色視為陰性，計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；黃色計(jì)2分；黃褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞率評(píng)分：<10% 視為陰性，計(jì)0分；10%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；>50%計(jì)3分?？偡?分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，>6 分為強(qiáng)陽性(+++)。由2名病理科主治醫(yī)師獨(dú)立閱片并進(jìn)行判定，評(píng)分不一致時(shí)取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Nupr1 mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR繪制的熔解曲線表明目的片段特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線，可排除污染因素影響。胃癌組織Nupr1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.10±0.60，明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.499，P=0.000)。

二、Nupr1蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，胃癌組織Nupr1蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.06±0.54，明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.531，P=0.000)(圖1)。胃癌組織中Nupr1蛋白表達(dá)與其mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)相一致，均顯著高于癌旁組織。

1 Da=0.992 1 u

三、免疫組化染色

免疫組化染色結(jié)果顯示，胃癌和癌旁組織中的Nupr1蛋白均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核內(nèi)也可見少量表達(dá)(圖2)。胃癌組織中Nupr1表達(dá)陰性、弱陽性、中等陽性和強(qiáng)陽性例數(shù)分別為8例、18例、20例和26例，陽性表達(dá)率為88.9%(64/72)；癌旁組織中Nupr1表達(dá)陰性、弱陽性、中等陽性和強(qiáng)陽性例數(shù)分別為57例、10例、5例和0例，陽性表達(dá)率為20.8%(15/72)。胃癌組織中的Nupr1表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=67.331，P=0.000)。

圖2 胃癌和癌旁組織Nupr1蛋白表達(dá)(免疫組化染色)

四、胃癌組織Nupr1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，胃癌組織中的Nupr1 mRNA表達(dá)與腫瘤體積、分化程度、病理類型、Bormann分型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

表1 胃癌組織Nupr1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理特征例數(shù)Nupr1mRNA相對(duì)表達(dá)量P值性別 男562．06±0．570．410 女162．21±0．71年齡 <60歲302．01±0．520．153 ≥60歲422．22±0．69腫瘤直徑 <5cm582．03±0．610．046 ≥5cm142．38±0．46腫瘤部位 胃底112．14±0．780．944 胃體262．07±0．60 胃竇352．10±0．55分化程度 高/中分化301．93±0．530．041 低分化422．22±0．62病理類型 管狀/乳頭狀腺癌561．98±0．570．020 印戒細(xì)胞癌/黏液腺癌162．49±0．53Bormann分型 息肉型/局限潰瘍型211．79±0．410．040 浸潤(rùn)潰瘍型/彌漫浸潤(rùn)型512．22±0．63T分期 T1+T2251．77±0．480．000 T3+T4472．27±0．59N分期 N0+N1491．94±0．560．010 N2+N3232．42±0．57遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 無672．05±0．580．027 有52．66±0．56TNM分期 Ⅰ+Ⅱ381．72±0．330．010 Ⅲ+Ⅳ342．52±0．54

討 論

胃癌因具有癌細(xì)胞增殖快、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的特點(diǎn)，致使很多患者在確診時(shí)已處于疾病晚期，50歲以上的患者5年生存率不超過28%[8]。近年關(guān)于胃癌病因和治療方面的研究已取得較大進(jìn)展，然而目前臨床治療仍無法達(dá)到腫瘤病變完全緩解的目標(biāo)，因此需要探索新的治療靶點(diǎn)以指導(dǎo)胃癌的臨床治療。

機(jī)體對(duì)于微環(huán)境改變?nèi)缛毖?、損傷、血清饑餓等可產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，從而適應(yīng)環(huán)境，保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)和功能。人類Nupr1基因定位于染色體16p11.2，其編碼蛋白是一個(gè)廣泛表達(dá)的應(yīng)激相關(guān)分子，生化特征類似于高遷移率族蛋白(high mobility group, HMG)[9]。Nupr1具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗炎[10]、細(xì)胞周期調(diào)控[11]、自噬[12]、抑制細(xì)胞凋亡[13]等，其介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)是腫瘤形成的重要因素[14]。越來越多的研究表明，Nupr1在多種惡性腫瘤組織中與正常組織相比存在差異表達(dá)，包括胰腺癌[15]、肝細(xì)胞癌[16-17]、乳腺癌[18]、結(jié)直腸癌[19]、非小細(xì)胞肺癌[20]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[21]、前列腺癌[22-23]、甲狀腺乳頭狀癌[24]等，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。Nupr1在腫瘤中的作用呈雙向性，既可表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力，亦可能對(duì)腫瘤進(jìn)展發(fā)揮抑制作用，如乳腺癌中Nupr1低表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)[18]；進(jìn)展期結(jié)直腸癌中的Nupr1表達(dá)水平較早期結(jié)直腸癌顯著降低[19]；前列腺癌中的Nupr1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及其侵襲性呈負(fù)相關(guān)，發(fā)揮抑癌作用[22-23]。此外，Nupr1還參與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生，如胰腺導(dǎo)管腺癌對(duì)吉西他濱的多重耐藥與Nupr1參與的應(yīng)激反應(yīng)依賴性信號(hào)通路有關(guān)[25]。

鑒于Nupr1在不同組織以及同一組織不同細(xì)胞定位中的表達(dá)量不盡相同，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化染色分別檢測(cè)了胃癌和癌旁組織中Nupr1在基因和蛋白水平的表達(dá)及其細(xì)胞定位，結(jié)果顯示胃癌組織中Nupr1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織，兩者的表達(dá)變化趨勢(shì)相一致，提示胃癌和癌旁組織中的Nupr1表達(dá)水平在基因轉(zhuǎn)錄階段已存在差異，在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中保持相對(duì)穩(wěn)定。以上研究結(jié)果表明，Nupr1可能參與了胃癌的發(fā)生、進(jìn)展過程。

本研究進(jìn)一步探討了Nupr1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的Nupr1 mRNA表達(dá)與腫瘤體積、分化程度、病理類型、Bormann分型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，腫瘤體積大、低分化、浸潤(rùn)深、存在淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚的患者，Nupr1表達(dá)顯著增高，與既往研究結(jié)果相似[26]。基于以上結(jié)果可初步推測(cè)，Nupr1高表達(dá)與胃癌進(jìn)展相關(guān)，提示患者的不良預(yù)后。

盡管Nupr1蛋白含有一個(gè)典型的NLS序列，是一種小分子核蛋白，但其細(xì)胞定位可因組織類型和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不同而發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤組織如結(jié)直腸癌[19]、低分化甲狀腺乳頭狀癌[24]中的Nupr1蛋白可發(fā)生明顯的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，此種細(xì)胞 定位改變可能受Nupr1 NSL序列乙酰化的調(diào)節(jié)[27]。本研究免疫組化染色顯示胃癌和癌旁組織中的Nupr1蛋白均發(fā)生明顯的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，但細(xì)胞核內(nèi)也可見少量表達(dá)，該定位特點(diǎn)與邢軍等[26]的研究發(fā)現(xiàn)Nupr1蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)均多在細(xì)胞核內(nèi)相反。Nupr1在胃癌細(xì)胞中的作用部位及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述， Nupr1在胃癌組織中高表達(dá)并可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，可作為胃癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的新標(biāo)記物。Lopez等[28]發(fā)現(xiàn)了Nupr1的同源蛋白Nupr1L，后者作為一種新的p53誘導(dǎo)基因，可在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)向調(diào)控Nupr1表達(dá)。在胃癌的臨床治療過程中，如能有效抑制Nupr1表達(dá)，或許能延緩胃癌進(jìn)展，改善患者預(yù)后，因此Nupr1有望成為胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。Nupr1參與胃癌發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究加以闡明。

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(2017-02-03收稿；2017-03-22修回)

Expression of Nupr1 in Gastric Cancer and its Clinical Significance

DINGMeiyu1,QIChao2,JIANGXiangjun1.
1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,QingdaoMunicipalHospital,DalianMedicalUniversity,Qingdao,ShandongProvince(266011)

JIANG Xiangjun, Email: drjxj@163.com

Stomach Neoplasms; Disease Progression; Nucleoproteins; Real-Time Polymerase Chain Reaction; Blotting, Western; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.08.004

*本文通信作者，Email: drjxj@163.com

Background: The morbidity and mortality of gastric cancer remain high worldwide, and it is urgent to explore new targets for the diagnosis and treatment of gastric cancer. Nuclear protein 1 (Nupr1) has a variety of biological functions, especially in the tumorigenesis and development of the malignancies. Aims: To investigate the expression and clinical significance of Nupr1 in gastric cancer. Methods: Quantitative RT-PCR was used to determine the mRNA expression of Nupr1 in 72 cases of gastric cancerous tissue and the paired paracancerous tissue. Western blotting and immunohisto-chemistry were employed to detect the protein expression and cellular localization of Nupr1. The correlation of Nupr1 with the clinicopathological characteristics of gastric cancer was analyzed. Results: Expressions of Nupr1 mRNA and protein in gastric cancer were both significantly higher than those in paracancerous tissue (P<0.05), and their expressions were coincident. Nupr1 protein was expressed mainly in cytoplasm, and the nuclear expression was reduced. Expression of Nupr1 mRNA in gastric cancer was significantly correlated with tumor size, differentiation, pathological type, Bormann’s classification, depth of invasion, lymph node and distant metastases and TNM staging (P<0.05), and was not correlated with gender, age and site of tumor (P>0.05). Conclusions: Nupr1 is overexpressed and correlated with invasion, metastasis and progression of gastric cancer. It can be used as a novel biomarker for early diagnosis and prognosis evaluation, and as a potential target for treatment of gastric cancer.