美洲大蠊提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響

吳道勛，邵維莉，常旭，歐紅麗，張瀚丹，陳俊雅，3*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.云南省昆蟲(chóng)醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

美洲大蠊提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響

吳道勛1，邵維莉1，常旭2，歐紅麗2，張瀚丹1，陳俊雅1，3*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.云南省昆蟲(chóng)醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

目的：研究美洲大蠊提取物對(duì)BALB∕c荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響。方法：灌胃給予BALB∕c荷瘤小鼠低、中、高劑量的（50、100、200 mg∕kg）美洲大蠊提取物（EPA），陽(yáng)性組給予環(huán)磷酰胺（CTX，50 mg∕kg），給藥10 d后處死小鼠，測(cè)定小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞和外周血中LY、MO、GR細(xì)胞的含量，并計(jì)算抑瘤率。結(jié)果：EPA能增加脾臟中CD8+的含量，與模型組相比，明顯提高腫瘤生長(zhǎng)抑制率（P＜0.05）。結(jié)論：美洲大蠊能抑制H22肝癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與脾臟中CD8+含量增加有關(guān)。

美洲大蠊；H22荷瘤小鼠；脾臟；淋巴細(xì)胞

美洲大蠊（Periplaneta americana）為昆蟲(chóng)綱，蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱(chēng)“蟑螂”，因其具有良好的活血化瘀功效，使得美洲大蠊成為國(guó)內(nèi)主要飼養(yǎng)的藥用蜚蠊。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)最早就有其藥用作用的記載，我國(guó)第一本經(jīng)典藥學(xué)專(zhuān)著《神農(nóng)本草經(jīng)》有關(guān)于蜚蠊的記載為“味寒咸，主血淤，瘕堅(jiān)，寒熱，破積聚，喉咽痹，內(nèi)寒，無(wú)子”，現(xiàn)代藥理學(xué)關(guān)于蜚蠊的藥用價(jià)值有了更深層次的發(fā)現(xiàn)，如組織修復(fù)，抗炎，抗心肌缺血，抗心律失常，抗肝臟損傷，抗腫瘤和免疫增強(qiáng)等作用〔1-7〕。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料BALB∕c小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（湘）2013-0004；美洲大蠊提取物（EPA，由大理大學(xué)劉光明教授提供）；環(huán)磷酰胺（CTX，山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：04131206）；XFA6000動(dòng)物血細(xì)胞分析儀用稀釋液（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PD1501）；HB探針清洗液（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PB9407）；ANI-3D溶血?jiǎng)暇┢绽梳t(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PF2402）；HB含酶清洗液（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PB7501）；FITC Hamster Anti-Mouse CD3e，（美國(guó)BD公司，批號(hào)：553062）；PE Rat Anti-Mouse CD4，（美國(guó)BD公司，批號(hào)：553049）；Per-CP Rat Anti-Mouse CD8a，（美國(guó)BD公司，批號(hào)：553036）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器臺(tái)式冷凍離心機(jī)（ScanSpeed，型號(hào)：1580MGR）；流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，美國(guó)BD公司）；全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：XFA6000）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 荷瘤小鼠造模取第2代腹水保種傳代的H22小鼠肝癌細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)量，保證細(xì)胞活率＞95%進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌條件下將細(xì)胞密度調(diào)整為2.0×106個(gè)∕mL，每只小鼠按0.2 mL接種于右腋皮下。

2.2 分組給藥取接種第2天后的BALB∕c小鼠30只，隨機(jī)分為5組，每組6只，實(shí)驗(yàn)設(shè)置模型組（注射生理鹽水），陽(yáng)性組（注射CTX，50 mg∕kg），EPA給藥組（低、中、高劑量分別為50、100、200mg∕kg），未接種瘤細(xì)胞小鼠為正常組。正常組和模型組每天給生理鹽水，陽(yáng)性組按0.1 mL∕10 g小鼠體重腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)給藥3 d，治療組按0.2 mL∕10 g小鼠體重給EPA，除陽(yáng)性組外其余各組連續(xù)給藥10 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞群的測(cè)定給藥12 h后，無(wú)菌操作取脾臟，置于細(xì)胞篩網(wǎng)上，用PBS（含3%血清）研磨成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為107個(gè)∕mL，取細(xì)胞懸液100 μL加入流式管中，做FITC-CD3-Ab、PE-CD4-Ab、Per-Cp-CD8-Ab抗體染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比。

2.3.2外周全血中淋巴細(xì)胞（LY）、單核細(xì)胞（MO）、中性粒細(xì)胞（GR）測(cè)定末次給藥后禁食12 h，眼內(nèi)眥靜脈取血，取20 μL加入稀釋液，用動(dòng)物血細(xì)胞分析儀測(cè)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

2.3.3抑瘤率的測(cè)定頸椎脫臼處死小鼠取腫瘤并稱(chēng)量，分別按下面公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率：腫瘤生長(zhǎng)抑制率=［（對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）∕對(duì)照組平均瘤重］×100%。

2.4 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組均數(shù)的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 EPA對(duì)外周血T細(xì)胞亞群的影響與正常組相比，EPA低、中、高劑量組對(duì)CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+∕CD8+有下調(diào)的作用（P＜0.05），對(duì)CD4+細(xì)胞無(wú)明顯作用；與陽(yáng)性組相比，EPA各組CD3+細(xì)胞均明顯的減少（P＜0.05或P＜0.01），EPA中、高劑量上調(diào)CD8+細(xì)胞、CD4+∕CD8+（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1和圖1～4。

表1 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響

表1 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響

注：與正常組相比#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比*P＜0.05；與陽(yáng)性組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

圖1 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的影響

圖2 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD4+∕CD8+細(xì)胞的影響

圖3 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD3+細(xì)胞的影響

圖4 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血中CD4+和CD8+細(xì)胞的影響

3.2 EPA對(duì)外周血LY、MO、GR的影響陽(yáng)性組與模型組相比LY、MO、GR的含量均明顯減少（P＜0.01）；EPA低、中、高劑量組與正常組相比，均能明顯增加MO、GR的含量（P＜0.05），與陽(yáng)性組相比，EPA各組均對(duì)LY、MO、GR的細(xì)胞數(shù)有增加作用，除EPA低劑量組對(duì)LY的作用外，其余各組均表現(xiàn)出顯著的差異（P＜0.05或P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2和圖5。

表2 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血LY、MO、GR的影響

表2 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血LY、MO、GR的影響

注：與正常組相比#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性組相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

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圖5 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠外周血中LY、MO、GR的影響

3.3 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤小鼠腫瘤抑制率的影響陽(yáng)性組與模型組相比，瘤重顯著性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；EPA中、高劑量組與模型組相比，瘤重明顯降低（P＜0.05），與陽(yáng)性組相比，EPA低、中劑量對(duì)瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；見(jiàn)表3和圖6。

表3 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤抑制率

表3 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤抑制率

注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性組相比△P＜0.05。

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圖6 EPA對(duì)H22肝癌腫瘤抑瘤率

4 分析和討論

腫瘤的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其產(chǎn)生的原因和治療手段都還未完全了解，但隨著對(duì)腫瘤與機(jī)體免疫的關(guān)系的深入研究，特別是對(duì)免疫微環(huán)境〔8〕、免疫監(jiān)視和免疫逃逸〔9〕等相關(guān)概念的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，免疫治療逐漸成為治療腫瘤的一種方式。細(xì)胞免疫是機(jī)體免疫的一種重要方式，免疫系統(tǒng)對(duì)病毒和化學(xué)原因引起的腫瘤免疫作用中，T淋巴細(xì)胞占有重要的作用〔10-11〕，T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓中的淋巴樣前祖細(xì)胞，在胸腺中發(fā)育成熟，其可分為若干個(gè)亞群，各亞群之間相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮其免疫學(xué)功能，其中CD3分子的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞抗原受體（TCR）的識(shí)別抗原所產(chǎn)生的活化信號(hào)作用，CD4和CD8分子只有成熟的T細(xì)胞才能表達(dá)，其主要功能輔助TCR識(shí)別抗原和參與T細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，成熟的T細(xì)胞按其CD分子表型不同可分為CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞，其分化后，CD4+主要為效應(yīng)Th細(xì)胞，而CD8+主要為細(xì)胞毒Tc細(xì)胞〔12〕，可特異性殺傷靶細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)用EPA作用H22肝癌移植瘤的BALB∕c小鼠，結(jié)果顯示，EPA相對(duì)于模型組能提高脾臟細(xì)胞中的CD8+的含量，CD4+∕CD8+的比值相對(duì)正常組也相對(duì)提高，與陽(yáng)性組相比，EPA中、高劑量對(duì)CD8+細(xì)胞、CD4+∕CD8+有增加的作用，表明EPA能提高細(xì)胞免疫功能。通過(guò)對(duì)血中的LY、MO、GR的測(cè)量結(jié)果顯示，EPA對(duì)荷瘤小鼠的外周中的LY、MO、GR相對(duì)模型組沒(méi)有明顯的改變作用，但與陽(yáng)性組相比，EPA各組均對(duì)LY、MO、GR的細(xì)胞數(shù)有增加作用，但在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面，EPA組的中劑量和高劑量組與模型組相比，能明顯的減輕腫瘤的重量，與陽(yáng)性組相比，EPA低、中劑量對(duì)瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EPA低、中、高劑量組抑瘤率分別為24.00%，38.29%，49.39%，說(shuō)明在抗腫瘤方面有一定的作用。

以上結(jié)果表明，EPA可通過(guò)調(diào)節(jié)脾淋巴細(xì)胞的含量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮一定的抗腫瘤活性，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)美洲大蠊的藥用價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

〔1〕牛春麗，曾菁，夏盟愷，等.肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對(duì)小鼠急性結(jié)腸炎的影響〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（4）:12-16.

〔2〕陳俊雅，李洪文，吳道勛，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3抗炎作用及機(jī)制研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（2）:8-11.

〔3〕陸麗，張旭強(qiáng)，甘平，等.美洲大蠊提取物對(duì)ISO致大鼠心肌缺血的保護(hù)作用〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，13（8）:7-10.

〔4〕彭麗，陸麗，張旭強(qiáng)，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)大鼠心律失常的保護(hù)作用〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，10（12）:6-9.

〔5〕張旭強(qiáng)，何旭，陳俊雅，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，10（12）:1-5.

〔6〕張小雪，李春艷，徐靜，等.美洲大蠊提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖能力的影響〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，11（6）:16-19.

〔7〕李嬌，張冰清，劉光明，等.美洲大蠊脫脂膏對(duì)小鼠免疫功能的影響〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（10）：1-5.

〔8〕廖云梅，阮志華.腫瘤微環(huán)境在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展〔J〕.免疫學(xué)雜志，2014，30（12）：1104-1107.

〔9〕王盛典，賈明明.腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤常規(guī)治療效應(yīng)中的作用〔J〕.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2012，19（3）：229-238.

〔10〕XIA Y H，WANG Z M，CHEN R X，et al.T-cell apoptosis induced by intratumoral activated hepatic stellate cells is associated with lung metastasis in hepatocellular carcino?ma〔J〕.Oncol Rep，2013，30（3）：1175-1184.

〔11〕WANG W J，TAO Z，GU W，et al.Variation of blood T lym?phocyte subgroups in patients with non-small cell lung cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（8）：4671-4673.

〔12〕張京雨，張曉明.CIK細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療對(duì)結(jié)直腸癌化療患者免疫指標(biāo)的影響〔J〕.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2009，22（1）：51-53.

The Effects of Periplaneta americana Extract on Spleen Lymphocytes of H22Tumor-bearing Mice

Wu Daoxun1,Shao Weili1,Chang Xu2,Ou Hongli3,Zhang Handan1,Chen Junya1,3*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali, Yunnan 671000,China;3.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To study the effects ofPeriplanet americanaextract on spleen lymphocytes of H22Tumor-bearing mice.Methods：BALB∕c mice were administered with low dose,middle dose and high dose ofPeriplaneta americanaextract（50,100,200 mg∕kg）by gavage.The positive group was injected with 50 mg∕kg cyclophosphamide.After 10-day feeding and injection respectively the content of T lymphocytes in the spleen,lymphocyte cells,Monocyte cells and granulocyte cells in peripheral blood were measured,and the anti-tumor rate was calculated.Results：ThePeriplaneta americanaextract could obviously increase the content of CD8+and the tumor growth inhibition rate（P＜0.05）compared with the normal group.Conclusion：Periplaneta americanaextract can inhibit the growth of H22liver tumor in mice and its mechanism may be related to the increase of the content of CD8+in the spleen.

Periplaneta americana；tumor H22-bearing mice；spleen；lymphocytes

R285

A

2096-2266（2017）08-0001-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.001

（責(zé)任編輯 李楊）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560600）；大理大學(xué)青年教師科研基金資助項(xiàng)目（KYQN201337；KYQN201309）

2016-09-30

2017-04-19

吳道勛，碩士研究生，主要從事天然藥物藥理學(xué)研究.

*通信作者：陳俊雅，實(shí)驗(yàn)師.