hMTERF3基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

孫美濤，梅雯，楊澤芳，丁小倩，張若鵬，張曉娟，熊偉*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖科，云南大理671000；3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理671000）

hMTERF3基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

孫美濤1，梅雯1，楊澤芳1，丁小倩1，張若鵬2，張曉娟3，熊偉1*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖科，云南大理671000；3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理671000）

目的：構(gòu)建和鑒定帶3×Flag標簽的人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3基因（hMTERF3）真核表達載體。方法：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因序列設(shè)計引物，采用聚合酶鏈式反應(yīng)從pGEM-hMTERF3重組克隆載體中擴增出hMTERF3基因開放閱讀框序列，經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后，連接入真核表達載體p3×FLAG-CMV-14的多克隆位點中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p3×FLAGCMV-hMTERF3，分別用菌落PCR、限制性核酸內(nèi)切酶分析和DNA序列分析3種方法鑒定重組子。結(jié)果：重組質(zhì)粒p3×FLAGCMV-hMTERF3經(jīng)雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定均獲得大小為1 254 bp的目的條帶，DNA序列分析和Blast序列比對結(jié)果表明該序列與GenBank中hMTERF3基因序列的同源性達到100%，插入基因的大小和方向均正確。結(jié)論：成功構(gòu)建了hMTERF3基因的真核表達載體，為進一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3；真核表達載體；鑒定

線粒體基因的表達調(diào)控與線粒體的功能密切相關(guān)〔1〕。人類線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（human mito?chondrial transcription termination factor，hMTERF）是一類由核基因組編碼，且能夠與線粒體DNA（mi?tochondrial DNA，mtDNA）特異結(jié)合的單體蛋白質(zhì)〔2〕。人類MTREF蛋白家族包括4個成員，分別為MTERF1～MTERF4，各成員主要參與線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程的調(diào)控〔3〕。目前，線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子僅在后生動物及植物中存在，在真菌中仍未發(fā)現(xiàn)與其同源的蛋白質(zhì)〔4〕。

hMTERF3（human mitochondrial transcription ter?mination factor 3，hMTERF3）基因又被命名為人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1（mitochondrial tran?scription termination factor domain containing 1，hM?TERFD1）〔5〕。hMTERF3基因位于8號染色體（8q22.1），包含11個外顯子〔6〕。研究顯示，哺乳動物MTERF3是一種線粒體蛋白質(zhì)，負調(diào)控線粒體的DNA轉(zhuǎn)錄水平和能量生成〔7〕。hMTERF3基因拷貝數(shù)擴增及其過表達對肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進展和預(yù)后有重要作用，但其在惡性腫瘤的作用機制還不清楚〔8〕。本實驗擬利用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）克隆hMTERF3基因編碼序列，構(gòu)建hMTERF3基因真核表達載體，為進一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制，以及尋找新的腫瘤基因治療靶點的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和載體大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞（博邁德生物技術(shù)有限公司）；重組DNA克隆載體pGEM-hMTERF3（Sino Biological公司）；真核表達載體p3×FLAG-CMV-14由云南大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室余敏副教授贈送。

1.2 試劑限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ（大連Takara公司）；2×Taq PCR Master Mix（Promega公司）；T4 DNA連接酶（Gene Copoeia公司）；Trans 2K DNA Maker、6×DNA Loading Buffer、DuRed核酸染料（北京全式金生物技術(shù)公司）；質(zhì)粒提取純化試劑盒（Omega公司）；DNA片段回收試劑盒（BioTeke公司）；瓊脂糖為西班牙進口分裝；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；PCR引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成，DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 儀器PCR擴增儀（德國Eppendorf AG公司）；BT423S型電子天平（德國Sarturios公司）；DYY-12C型電泳儀（北京六一儀器廠）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；TAZ-84A臺式恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器總廠）；TGL-16C臺式高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-4恒溫水浴鍋（上海國華電器有限公司）；微量移液器（上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；LDZX-50FA立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.4 方法

1.4.1引物設(shè)計檢索GenBank數(shù)據(jù)庫得到hM?TERF3基因（Gene ID：557786089）的轉(zhuǎn)錄本，PCR引物設(shè)計參照hMTERF3基因序列完整的轉(zhuǎn)錄本1（NM_015942.4）。上游引物P1（引入HindⅢ酶切位點）：5'-GCGAAGCTTATGGCTTTGTCAGCCCA-3'，下游引物P2（引入BamHⅠ酶切位點）：5'-GCGGG?TACCAAGCGTTTTTAAGAATT-3'，下劃線部分為酶切位點，之前為保護堿基。預(yù)期的DNA擴增片段長度為1 254 bp。

1.4.2hMTERF3基因的PCR擴增和電泳檢測以重組克隆質(zhì)粒pGEM-hMTERF3為模板，用上、下游引物進行PCR擴增hMTERF3基因，反應(yīng)體系為25 μL，其中模板DNA 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃再延伸5 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測擴增產(chǎn)物的片段大小。

1.4.3 p3×FLAG-CMV-hMTERF3真核載體的構(gòu)建與PCR鑒定將hMTERF3基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后，與真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-14分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳，并經(jīng)過凝膠回收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將外源目的基因和真核表達載體酶切純化的產(chǎn)物按照3：1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，然后取200 μL菌液涂布于含氨芐青霉素100 μg∕mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含50 μg∕mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中，37℃，200 r∕min振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的菌液進行菌落PCR擴增以鑒定是否存在插入片段。菌落PCR鑒定引物為P1∕P2，反應(yīng)體系25 μL，其中菌液1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃再延伸5 min。擴增產(chǎn)物取5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定擴增產(chǎn)物大小。如果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確則用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

1.4.4 p3×FLAG-CMV-hMTERF3真核表達載體的酶切鑒定和測序鑒定將提取的重組真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3同時用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將酶切鑒定正確的重組真核表達質(zhì)粒進行測序鑒定，重組質(zhì)粒的測序引物：上游引物5'-CGCAAAT?GGGCGGTAGGCGTG-3'，下游引物5'-CCAGCTTG?GTTCCCAATAGA-3'。DNA測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1hMTERF3基因的PCR產(chǎn)物電泳分析利用PCR從pGEM-hMTERF3克隆載體擴增得到hMTERF3基因完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）片段。hMTERF3基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 254 bp處可見清晰、單一的的擴增條帶，與預(yù)期的片段大小一致。見圖1。

圖1 hMTERF3基因PCR擴增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的構(gòu)建目的基因和p3×FLAG-CMV-14空載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，并采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3，用空載體作為對照進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，提取質(zhì)粒的質(zhì)量良好，純度較高，無蛋白質(zhì)和RNA的污染。見圖2。

圖2 p3×FLAG-CMV-hMTERF3重組質(zhì)粒電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的鑒定重組表達載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3的菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在1 254 bp處可見一條特異性的目的條帶。見圖3。提取純化的重組表達載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見大小約為6 310 bp的載體條帶與1 254 bp的目的條帶兩個片段?？蛰d體p3×FLAG-CMV-14經(jīng)上述兩個酶雙酶切后，僅見一條6 310 bp的載體條帶。見圖4。

圖3 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3

圖4 HindⅢ∕BamHⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒p3× FLAG-CMV-hMTERF3

2.4 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的序列分析鑒定對質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3上的多克隆位點內(nèi)的外源DNA進行序列分析鑒定，測序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank檢索到的編碼序列（NM_ 015942.4）同源性為100%，說明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。見圖5。

3 討論

線粒體是細胞中的重要細胞器，細胞的能量供應(yīng)來自于線粒體。隨著人們對線粒體基因轉(zhuǎn)錄機制和人類線粒體疾病的深入研究，對人類MTERF蛋白家族的研究已成為一個熱點〔9-10〕。MTERF3基因是MTERF基因超家族中進化最保守的成員，在低等的果蠅到高等的哺乳動物細胞中都存在同源基因〔11〕。hMTERF3基因定位于人類8號染色體（8q22.1），基因全長22 216 bp，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子〔6〕。hMTERF3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物共417個氨基酸，N端1～68個氨基酸為進入線粒體的導(dǎo)肽，其后349個氨基酸為成熟的hMTERF3蛋白。我們在前期研究中，成功地在大腸埃希菌中原核表達和純化了hMTERF3蛋白，并制備了小鼠抗hMTERF3多克隆抗體。進一步采用細胞免疫熒光的方法證實，hMTERF3蛋白定位在人宮頸癌HeLa細胞的線粒體上〔12〕。WRDENBERG等〔13〕的研究顯示，哺乳動物MTERF3不僅負性調(diào)節(jié)mtDNA轉(zhuǎn)錄，而且能通過調(diào)節(jié)線粒體中核糖體大亞基的組裝，影響核糖體的生物合成〔7〕。HYV?RINEN等用二維瓊脂糖凝膠電泳法對mtDNA復(fù)制中間體的研究發(fā)現(xiàn)，在胚腎293T細胞中過表達hMTERF3能抑制線粒體DNA復(fù)制，造成細胞內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)的下降〔13-14〕。這些結(jié)果進一步提示，hMTERF3可能還參與抑制mtDNA復(fù)制過程中復(fù)制中間體的形成及復(fù)制叉的延伸。

圖5 Blast程序比對重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3部分測序結(jié)果

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在人類肝癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中mtDNA含量和線粒體呼吸鏈酶活性降低，這提示惡性腫瘤中參與線粒體基因表達調(diào)控的蛋白因子可能存在著表達異?！?5-17〕。ZHANG等的研究表明，hMTERF3基因擴增和表達異常與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切〔8〕。但hMTERF3基因在腫瘤細胞中具體作用機制亟待進一步研究。

本實驗中使用的p3×FLAG-CMV-14是一個典型的真核表達載體，能在哺乳動物細胞中高效表達外源基因，從而實現(xiàn)目的基因的過表達。構(gòu)建的真核表達載體為質(zhì)粒，比病毒載體安全性更高，真核表達載體p3×FLAG-CMV-14含有多克隆位點，便于目的基因插入至載體〔18〕。同時，載體上含有氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和新霉素抗性基因（Neor）使得質(zhì)粒容易篩選，構(gòu)建好的重組真核表達載體能夠穩(wěn)定在宿主細胞內(nèi)復(fù)制和高效表達。p3×FLAGCMV-14載體上的FLAG標記物是專為標記目的蛋白質(zhì)設(shè)計的多肽標記物，其特點是標記物的序列不是來自任何已知的蛋白質(zhì)。該標記物是由8個氨基酸組成的多肽，具有親水性，可以置于外源蛋白質(zhì)的羧基末端〔19〕。目前，已有商品化的FLAG抗體可識別標記物，方便進行外源蛋白質(zhì)的檢測。通過本實驗構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒，可為下一步研究hMTERF3基因?qū)δ[瘤細胞氧化磷酸化活性和惡性生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。

〔1〕時多，王璐，周運恒，等.線粒體基因表達的調(diào)控及其與某些疾病的關(guān)系〔J〕.生命的化學(xué)，2006，26（3）：250-252.

〔2〕ROBERTI M，POLOSA P L，BRUNI F，et al.The MTERF family proteins：mitochondrial transcription regulators and beyond〔J〕.BiochimBiophysActa，2009，1787（5）：303-311.

〔3〕熊偉，余敏，左紹遠.線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族在線粒體基因表達中的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2015，31（3）：223-231.

〔4〕ROBERTI M，POLOSA P L，BRUNI F，et al.MTERF fac?tors：a multifunction protein family〔J〕.Biomol Concepts，2010，1（2）：215-224.

〔5〕ROBERTI M，BRUNI F，LOGUERCIO POLOSA P，et al.MTERF3，the most conserved member of the mTERF-fami?ly，is a modular factor involved in mitochondrial protein synthesis〔J〕.Biochim Biophys Acta，2006，1757（9∕10）：1199-1206.

〔6〕高菁霞.線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（mTERF）對細胞增殖影響的研究〔D〕.昆明：云南大學(xué)，2007.

〔7〕PARK C B，ASIN-CAYUELA J，CáMARA Y，et al.MTERF3 is a negative regulator of mammalian mtDNA transcription〔J〕.Cell，2007，130（2）：273-285.

〔8〕ZHANG C，WU N，GAO F，et al.MTERFD1 functions as an oncogene〔J〕.Oncotarget，2016，8（10）：1-8.

〔9〕BONAWITZ N D，CLAYTON D A，SHADEL G S.Initiation and beyond：multiple functions of the human mitochondrial transcription machinery〔J〕.Mol Cell，2006，24（6）：813-825.

〔10〕孫美濤，王昀，李月，等.hMTERF3基因啟動區(qū)的生物信息學(xué)分析〔J〕.大理大學(xué)學(xué)報，2017，2（2）：40-45.

〔11〕MONTOYA J，LóPEZ-PéREZ M J，RUIZ-PESINI E.Mi?tochondrial DNA transcription and diseases：Past，present and future〔J〕.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Bioenergetics，2006，1757（9）：1179-1189.

〔12〕楊勇琴，張成桂，孫美濤，等.人MTERF3蛋白的原核表達與多克隆抗體制備〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2016，29（10）：1020-1025.

〔13〕WREDENBERG A，LAGOUGE M，BRATIC A，et al.MTERF3 regulates mitochondrial ribosome biogenesis in invertebrates and mammals〔J〕.PLoS Genet，2013，9（1）：e1003178.

〔14〕HYV?RINEN A K，POHJOISM?KI J L，HOLT I J，et al.Overexpression of MTERFD1 or MTERFD3 impairs the completion of mitochondrial DNA replication〔J〕.Mol Biol Rep，2011，38（2）：1321-1328.

〔15〕李海霞，張淑蘭.線粒體DNA在婦科惡性腫瘤中的研究進展〔J〕.國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2009，36（1）：53-55.

〔16〕韓琤波，李凡，楊雪飛，等.胃癌線粒體DNA拷貝量的變化〔J〕.世界華人消化雜志，2004，12（2）：258-261.

〔17〕高園，聶鴻靖，楊棟，等.肝癌患者單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)與抗氧化能力的變化〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（1）：1-5.

〔18〕嚴會文，蘇敏，高杰，等.大鼠PAX6基因真核表達載體構(gòu)建及鑒定〔J〕.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，41（3）：288-293.

〔19〕張海洋，馮慕華，徐彤，等.人核呼吸因子2基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報，2014，13（2）：37-42.

Construction and Identification of Eukaryotic Expression Vector of Human MTERF3

Sun Meitao1,Mei Wen1,Yang Zefang1,Ding Xiaoqian1,Zhang Ruopeng2,Zhang Xiaojuan3,Xiong Wei1*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Department of Reproductive Medicine,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;3.Department of Respiratory Medicine,Dali Teaching Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To construct and identify the eukaryotic expression vector of FLAG-tagged human MTERF3 gene.Methods：The human MTERF3 gene was amplified by Polymerase Chain Reaction（PCR）.The recombinant products of the p3×FLAG-CMV-hMTERF3 were gained by T4 DNA ligase connecting MTERF3 gene fragment and eukaryotic expression vector p3×FLAG-CMV-14 with restriction enzymes HindⅢand BamHⅠ.The recombinant pasmid p3×FLAG-CMV-hMTERF3 were identified by colony PCR, double restriction enzyme digest and DNA sequencing.Results：A specific band of 1 254 bp was detected from recombinant plasmid p3×FLAG-CMV-hMTERF3 by digestion of HindⅢand BamHⅠ.The sequencing and identification showed that homology between this sequence and the human MTERF3 gene sequence from GenBank was 100%,and the size and the direction of the inserted gene were right.Conclusion：The eukaryotic expression vector of human MTERF3 was constructed successfully,which may lay the foundation for a further study of the interaction mechanism between behavior of MTERF3 in tumor cells and its development.

human MTERF3;eukaryotic expression vector;identification

Q78

A

2096-2266（2017）08-0018-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.005

（責(zé)任編輯 李楊）

國家自然科學(xué)基金資助項目（31601155；81560458）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目（2014Z126）；大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃資助項目（CXCY-X-2016-18）；大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項目（KYSX201609）

2017-01-04

2017-01-21

孫美濤，碩士研究生，主要從事細胞分子生物學(xué)研究.

*通信作者：熊偉，副教授，博士.