謝 東，劉 林，王 獻(xiàn)

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

分析與測(cè)試

全氟辛烷磺酸與載脂蛋白AⅠ非共價(jià)鍵復(fù)合物的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)探究

謝 東，劉 林，王 獻(xiàn)*

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

本文采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)方法，分析研究了載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)、全氟辛烷磺酸(PFOS)與Apo AⅠ結(jié)合的最佳實(shí)驗(yàn)條件和儀器參數(shù)。探討了電噴霧離子源溫度和碎裂電壓對(duì)Apo AⅠ蛋白質(zhì)多電荷質(zhì)譜峰信號(hào)的影響，以及在最佳儀器條件下(電噴霧離子源溫度為200 ℃，碎裂電壓為175 V)，獲得了PFOS-Apo AⅠ形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物質(zhì)譜譜圖。在該條件下，Apo AⅠ最多能與PFOS形成化學(xué)計(jì)量比為1：4的蛋白質(zhì)復(fù)合物。

電噴霧質(zhì)譜；載脂蛋白AⅠ；全氟辛烷磺酸；蛋白質(zhì)復(fù)合物

全氟化合物由于具有良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活的各個(gè)方面，其存在于半導(dǎo)體的制造及廚具涂料、紡織品等表面活性劑、表面保護(hù)劑中[1-2]。但近幾年研究報(bào)道稱，以全氟辛酸和全氟辛烷磺酸及其鹽類(lèi)為代表的全氟化合物具有持久性、高度生物累積性、生物體多臟器等毒性[3-4]。在中國(guó)各地區(qū)的人血漿檢測(cè)中，沈陽(yáng)地區(qū)PFOS的含量最高，達(dá)到79.2 ng/mL，天津地區(qū)的含量最低為3.72 ng/mL[5]。Dallaire等人[6]發(fā)現(xiàn)這些多鹵化物會(huì)改變甲狀腺素水平。Nelson等人[7]報(bào)道全氟化物會(huì)擾亂脂質(zhì)和體重的調(diào)節(jié)，使低密度脂蛋白含量增高，同時(shí)PFOS的暴露會(huì)導(dǎo)致總膽固醇含量高達(dá)13.4 mg/dL。

載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分[8]。在生命體的生理作用中，Apo A I不僅能識(shí)別和穩(wěn)定HDL受體蛋白，并且在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的相關(guān)酶的活性上，發(fā)揮著極其重要的作用[9-10]。雖然研究表明，全氟類(lèi)化合物能與脂肪酸運(yùn)載蛋白結(jié)合[11]，但有關(guān)全氟類(lèi)化合物與載脂蛋白的相互作用的質(zhì)譜研究還鮮有報(bào)道。本文采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)軟電離技術(shù)檢測(cè)了PFOS與Apo AⅠ形成的非共價(jià)鍵復(fù)合物，探索了檢測(cè)PFOS-Apo AⅠ蛋白質(zhì)復(fù)合物的最佳實(shí)驗(yàn)條件。通過(guò)優(yōu)化ESI離子源的儀器參數(shù)，盡可能地保持蛋白質(zhì)與配體分子的弱相互作用，同時(shí)獲得最佳的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ，85%，美國(guó)Sigma公司)；乙酸銨(99.0%，阿拉丁公司)；冰醋酸(分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)Waltman公司)；全氟辛烷磺酸(200 μmol·L-1，美國(guó)Sigma公司)。

6520 ESI Q-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜分析儀(美國(guó)Agilent公司)；GL-20高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀器離心機(jī)有限公司)；Milli-Q Advantage A10數(shù)位超純水系統(tǒng)Type Ι(美國(guó)Millipore公司)；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅勒特-托利多儀器上海有限公司)；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠); FA1004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 溶液配制

配制pH值6.9醋酸銨緩沖溶液溶解 Apo AⅠ樣品至所需濃度，和蛋白質(zhì)與PFOS的濃度比為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8的一系列待測(cè)溶液，每一濃度下平行重復(fù)3次，最終蛋白質(zhì)濃度為2.5 μmol·L-1。將配制好的混合溶液均放置在37 ℃的恒溫水浴鍋中恒溫孵育30min，然后進(jìn)行ESI-MS的檢測(cè)。

1.3 儀器條件

型號(hào)6520的ESI-Q-TOF MS儀器模式采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)，樣品以標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣方式采取自動(dòng)進(jìn)樣。液相色譜的流動(dòng)相為超純水，儀器采集范圍600～3800 m/z。在一定的干燥氣溫度、碎裂電壓，設(shè)置干燥氣流速為8 L·min-1，噴霧器壓力65 psig，毛細(xì)管電壓3500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 Apo AⅠ蛋白的ESI-MS實(shí)驗(yàn)條件摸索研究

2.1.1 電噴霧離子源溫度的影響

圖1 不同離子源溫度下的Apo AⅠ的ESI-MS質(zhì)譜圖

在保持其他條件不變的情況下，ESI-MS檢測(cè)了不同的離子源溫度對(duì)Apo AⅠ蛋白質(zhì)的多電荷離子分布圖譜，如圖1所示，分別對(duì)應(yīng)離子源溫度為200，250，275，300℃的質(zhì)譜譜圖。Apo AⅠ信號(hào)較強(qiáng)的離子峰多電荷分布區(qū)域主要包括+11至+15，和+21至+35。高質(zhì)荷比區(qū)的離子峰，蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)較少，即反映了天然狀態(tài)下結(jié)構(gòu)較緊致的蛋白質(zhì)構(gòu)象，而蛋白質(zhì)去折疊后所帶電荷數(shù)增加，主要形成低質(zhì)荷比分布的離子峰。當(dāng)離子源溫度升高至275℃時(shí)，電荷分布為+11至+15的離子峰信號(hào)強(qiáng)度較250℃時(shí)低，因此250℃比275℃的條件下更能反映蛋白的自然狀態(tài)。當(dāng)溫度升高至300℃時(shí)，僅存在部分自然態(tài)狀態(tài)下的多電荷峰，并且整體向低質(zhì)荷比區(qū)偏移，表明絕大多數(shù)蛋白質(zhì)已經(jīng)解離。因此，在溫和的溫度下更利于檢測(cè)未解離狀態(tài)下的蛋白質(zhì)。但在200℃的溫度下質(zhì)譜檢測(cè)到的多電荷峰強(qiáng)度反而較低，可能由于溫度較低影響去溶劑化效果，造成樣品的離子化效率降低，靈敏度下降。

2.1.2 電噴霧碎裂電壓的影響

圖2 不同碎裂電壓下的Apo AⅠ蛋白的ESI-MS譜圖

電噴霧質(zhì)譜的碎裂電壓是影響蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物多電荷分布的另一關(guān)鍵因素。改變碎裂電壓分別為175、200、250 V，如圖2可見(jiàn)，當(dāng)裂解電壓逐漸增加，電荷分布為+11至+15的自然態(tài)下蛋白質(zhì)多電荷峰的信號(hào)強(qiáng)度和個(gè)數(shù)都有明顯降低。這是由于溫和的碎裂電壓更利于檢測(cè)未解離狀態(tài)下的蛋白質(zhì)多電荷峰。綜合多電荷峰個(gè)數(shù)及信噪比可知，在碎裂電壓為175 V時(shí)，為蛋白質(zhì)檢測(cè)的最優(yōu)條件。

2.2 PFOS與Apo AⅠ蛋白復(fù)合物的ESI-MS檢測(cè)

上述Apo AⅠ空白蛋白質(zhì)譜條件的優(yōu)化，為PFOS與Apo AⅠ復(fù)合物的檢測(cè)提供了參考。在其他條件不變的情況下，選取在不同離子源溫度及碎裂電壓下進(jìn)行檢測(cè)PFOS-Apo AⅠ的復(fù)合物峰(離子源溫度和碎裂電壓分別為：200℃、225℃、250℃；175V、200V、250 V)。當(dāng)離子源溫度為200 ℃時(shí)， Apo AⅠ能與4個(gè)PFOS結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。隨著溫度的增高，配體結(jié)合數(shù)目及復(fù)合物峰強(qiáng)度均有降低，這是由于較高溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，從而不利于與配體形成穩(wěn)定的復(fù)合物峰。同時(shí)，考察了碎裂電壓的影響，在175 V時(shí)的質(zhì)譜信號(hào)最強(qiáng)，是由于在較溫和的碎裂電壓下更利于檢測(cè)蛋白質(zhì)復(fù)合峰。對(duì)比復(fù)合物的結(jié)合峰強(qiáng)度及結(jié)合配體的個(gè)數(shù)可知，200 ℃、175 V更適合檢測(cè)PFOS-Apo AⅠ非共價(jià)鍵復(fù)合物，見(jiàn)圖3。

A)干燥氣溫度200 ℃；B)碎裂電壓175 V； C) 干燥氣溫度225 ℃；D) 碎裂電壓200 V；E)干燥氣溫度250 ℃；F)碎裂電壓250 V

圖3 Apo AⅠ與PFOS配體分子的ESI-MS譜圖

Fig.3 ESI-MS spectra under optimal conditions for the solution of Apo AⅠand PFOS at 1:4 molar concentration ratio

3 結(jié)論

由于分析檢測(cè)非共價(jià)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物，需要盡可能地保持蛋白質(zhì)與配體的弱相互作用，又要保證較高的靈敏度以獲得最強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)，因此實(shí)驗(yàn)條件的探索對(duì)PFOS-Apo AⅠ的檢測(cè)十分關(guān)鍵。本文分別探索了自然態(tài)的Apo AⅠ蛋白質(zhì)，以及PFOS-Apo AⅠ復(fù)合物質(zhì)譜檢測(cè)的最佳條件。PFOS-Apo AⅠ復(fù)合物ESI-MS檢測(cè)的最佳條件為：離子源溫度200 ℃，碎裂電壓175 V，進(jìn)樣體積為5 μL。Apo AⅠ最多能結(jié)合4個(gè)PFOS配體分子，分別形成化學(xué)計(jì)量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的蛋白質(zhì)復(fù)合物。

[1]胡存麗,仲來(lái)福.全氟辛烷磺酸和全氟辛酸毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2006,19(6):354-358.

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(本文文獻(xiàn)格式：謝 東，劉 林，王 獻(xiàn).全氟辛烷磺酸與載脂蛋白AⅠ非共價(jià)鍵復(fù)合物的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)探究[J].山東化工,2017,46(11):88-90.)

Mass Spectrometric Analysis of Noncovalent Protein Complex of Perfluorooctane Sulfonic Acid and Apolipoprotein AⅠ

XieDong,LiuLin,WangXian*

(College of Chemistry and Material Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074，China)

In this work,we have analyzed apolipoprotein AⅠ (Apo AⅠ),and the protein complex of Apo AⅠcombined with perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) by electrospray mass spectrometry (ESI-MS),The key parameters of ESI-MS and experiment conditions have been optimized. The effects of source temperature and fragmentor voltage on Apo AⅠESI-MS spectra have been explored. Under the optimal experiment conditions (i.e. electrospray ion source temperature at 200 ℃,fragmentor voltage at 175 V),we have detected the s
Table protein complex of PFOS and Apo AⅠ. Results showed that at this conditions,Apo AⅠcan combined with PFOS at an maximal stoichiometric ratio of 1∶4.

electrospray mass spetrometry; apolipoprotein AⅠ;perfluorooctane sulfonic acid;protein complex

2017-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21675176，21275167)；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014CFA025)

謝 東(1992—)，女，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)；王 獻(xiàn)(1978-)，女，湖北武漢人，博士，教授，主要從事質(zhì)譜分析研究。

TQ028;O657.63

A

1008-021X(2017)11-0088-03