張 姝， 胡 蓉，黃 健*， 吳建偉*，國 果，付 萍，修江帆，尚小麗

(1.貴州醫(yī)科大學臨床基礎(chǔ)檢驗學教研室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學人體寄生蟲學教研室 貴陽 550004)

家蠅β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重組表達

張 姝1， 胡 蓉2，黃 健1*， 吳建偉2*，國 果2，付 萍2，修江帆2，尚小麗2

(1.貴州醫(yī)科大學臨床基礎(chǔ)檢驗學教研室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學人體寄生蟲學教研室 貴陽 550004)

克隆家蠅內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，BG)基因并建立原核表達體系，檢測其表達產(chǎn)物的活性，了解家蠅內(nèi)源性BG酶特點，為進一步解釋家蠅極強環(huán)境適應能力和發(fā)現(xiàn)新的種群控制措施提供分子生物學基礎(chǔ)。以草地貪夜蛾等結(jié)構(gòu)信息相對完整且研究較為透徹的6種代表性昆蟲的BG酶基因序列為參照對象，利用同源克隆結(jié)合RACE-PCR的方法，從家蠅cDNA中克隆得到BG酶基因的全長cDNA序列并對其進行生物信息學分析。分別采用原核表達載體pET-28a(+)構(gòu)建原核表達體系并在大腸桿菌E.coliBL21(DE3) 中誘導表達BG酶基因的融合蛋白。采用七葉苷平板顯色法和DNS法檢測表達體系融合蛋白的酶活性，并對其性質(zhì)進行初步的分析。家蠅體內(nèi)克隆得到了長度為1933 bp的家蠅BG酶基因全長cDNA序列，推導其為562個氨基酸殘基組成的蛋白多肽。重組原核質(zhì)粒經(jīng)誘導表達后，在65 kDa附近均出現(xiàn)特異性蛋白條帶，證實重組質(zhì)粒成功表達。重組表達的家蠅BG酶兼具內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蠅BG酶是一種新的多功能纖維素酶，是昆蟲纖維素酶研究的重要補充。

家蠅；β-葡萄糖苷酶；克?。?異源性表達； 酶活性

家蠅Muscadomestica，蠅科、家蠅屬，屬于雙翅目，繁殖力極強，是生態(tài)環(huán)境中的分解者(Shahetal. , 2016；Sacktonetal. , 2017)。觀察家蠅在不同生理狀態(tài)下對食物中纖維素利用情況的研究中，課題組發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)家蠅后的飼料比飼養(yǎng)前的質(zhì)地松軟，飼養(yǎng)后的飼料中粗纖維含量較飼養(yǎng)前顯著降低，且發(fā)現(xiàn)家蠅能夠產(chǎn)生內(nèi)源性纖維素酶(張姝等，2013；胡蓉等，2016)。但家蠅的纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)不清楚，國內(nèi)外其他研究團隊也未有報道。因此，對家蠅內(nèi)源性纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)進行研究，不但為深入闡明家蠅在復雜孳生環(huán)境中的生理基礎(chǔ)和生態(tài)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且有望通過對家蠅纖維素酶基因進行改造分子、沉默或阻斷家蠅內(nèi)源性纖維素酶基因從而達到抑制或干擾家蠅纖維素酶活性，為家蠅生態(tài)控制提供一條新的途徑。β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)是纖維素酶重要組成部分，能催化水解芳香基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖，可以消除纖維二糖對纖維素酶的負反饋作用,在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的降解、利用過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(張文慶等，2008；Jamesetal. , 2010；Singhetal. , 2016；Seddigh et al. , 2016)。綜上所述，本研究以家蠅為供試昆蟲，選擇纖維素酶體系中限速酶-BG酶為研究標示分子，根據(jù)與其親源關(guān)系相近物種的BG酶氨基酸序列的保守片段設(shè)計簡并引物，對家蠅內(nèi)源性BG酶進行基因克隆、生物信息學分析、進行原核重組表達及其表達產(chǎn)物的活性檢測，了解家蠅纖維素酶系的獨特性，為發(fā)現(xiàn)新的、有效纖維素酶體系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為進一步解釋家蠅的極強環(huán)境適應能力以及新的種群控制措施提供分子生物學基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1供試昆蟲

家蠅由貴州醫(yī)科大學人體寄生蟲教研室保存。養(yǎng)蠅房恒溫25℃，光周期12 L ∶12 D，成蟲以水、奶粉和白糖喂食，幼蟲以麥麩和水為食料。

1.1.2主要試劑

質(zhì)粒pMD19-T Vector、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、Ex Taq 酶、MiNiBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0回收試劑盒、dNTP Mixture、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0、Primer STARTM HS DNA Polymerase(TaKaRa)； 大腸桿菌表達載體pET-28a(+)、T4DNA ligase、 EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶(NEB)；水楊苷、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素(Sigma)；定性濾紙(杭州特種紙業(yè)有限公司)；3,5-二硝基水楊酸(DNSA,Genview)。

1.1.3主要儀器

PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國GE公司)；紫外分光光度計(美國GE公司)；Millipore 0.22 μm/0.45 μm濾器(美國)；Milli-Q超純水儀(法國Millipore Pharmacia公司)；CT15RE高速冷凍離心機(HITACHI公司)；μ-Quant酶標分光光度儀(美國Bio-Tek公司)；超聲波破碎儀(中國新芝公司)。

1.2 方法

1.2.1簡并引物設(shè)計及篩選

從NCBI數(shù)據(jù)庫搜索昆蟲BG酶基因核苷酸序列，確定6個具有代表性的BG酶基因，分別是草地貪夜蛾(AF052729.1)，馬德拉蜚蠊(AAL40863)，大黃粉蟲(AF312017.1)，臺灣乳白蟻(JN565079.1)，黑翅大白蟻(GU591172.1)，大紅斑蝶(AGBW01002988.1)。登陸B(tài)LOCK Maker網(wǎng)站，對上述6個序列進行比對，尋找到高度保守的連續(xù)核苷酸序列區(qū)。從BLOCK Maker Results 網(wǎng)頁直接登陸COPEHOP數(shù)據(jù)庫進行引物設(shè)計。參數(shù)為: Maximum core degeneracy: 64; Targetclamp temperature: 60℃; Genetic code: standard;Codon usage table:Platichthys flesus。用Primer Premier 5.0、DNAman、Oligo 6.0軟件進行引物優(yōu)化。

1.2.2總RNA提取及第一鏈cDNA的合成

取5 μg采用Trizol法提取的家蠅3齡幼蟲的總RNA，按照Invitrogen的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-PCR擴增家蠅BG酶基因保守區(qū)域

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用TaKaRa公司的Prime STAR HS DNA Polymerase 和簡并引物組合對進行PCR擴增，同時以不加模版作為陰性對照。反應體系為25 μL。反應條件: 98℃ 10 sec,65-55℃ 15 sec，72℃ 30 sec , 30個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后。進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆送上海生工測序。

1.2.4家蠅BG酶基因5′RACE 擴增

根據(jù)家蠅β-葡萄糖苷酶cDNA的保守區(qū)域采用Primer 5.0軟件設(shè)計用于5′末端擴增的基因特異性引物GSP1、GSP2和GSP3。按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒說明書進行家蠅BG酶基因的5′RACE 擴增。用GSP1合成第一鏈cDNA，使用引物GSP2和試劑盒所帶的橋連鉚釘引物AAP對已經(jīng)加尾的家蠅cDNA進行PCR第一輪擴增。將第一次的PCR產(chǎn)物用特異引物GSP3和試劑盒里面帶的橋連通用擴增引物AUAP進行巢式PCR第二輪擴增。PCR反應條件均為：95℃預變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min，進行34個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min，4℃進行保存。獲得的片段采用與方法1.2.4 相同的步驟進行回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗證。

1.2.5家蠅BG酶基因的3′RACE 擴增

根據(jù)Clontech 的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒說明書構(gòu)建了家蠅BG酶基因 的3′RACE 片段。第一輪PCR 采用3′GSP1 和UPM 引物，第二輪巢氏PCR 采用3′GSP2 和NUP 引物進行擴增，作為模板第一輪PCR ℃產(chǎn)物稀釋50倍;RACE-PCR 擴增的程序均為: 預變性94℃，5 min; 然后30個循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min。獲得的片段采用與方法1. 2. 4 相同的步驟進行回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗證。

1.2.6家蠅BG酶基因全長cDNA的獲得

應用conting Express和DNAman軟件將獲得保守區(qū)域、3′端和5′端進行序列拼接，最終獲得全長cDNA。利用NCBI的在線工具OFR Finder查找其開放閱讀框(ORF)。采用Premier 5.0 軟件對拼接的序列進行引物設(shè)計，通過PCR擴增進行家蠅cDNA的基因驗證。擴增產(chǎn)物檢測、克隆及測序方法同1.2.3。

1.2.7基因核酸序列及其所編碼氨基酸序列的生物信息學分析

測序得到的序列運用NCBI的BLAST程序(http://ncbi.nlm.nih.gov)進行分析。用Premier 5.0軟件進行家蠅BG酶基因全長氨基酸序列推導。采用DNAman預測其分子量和等電點等基本性質(zhì)。利用生物信息學網(wǎng)站ExPASy (Expert Protein Analysis System http://www.expasy.org/)中的TMpred對MAF-1進行跨膜區(qū)分析，用SignalP 4.0 Server進行信號肽分析，用PSORT Ⅱ server 進行亞細胞定位分析，用SMART進行功能域的預測，用SOPMA進行二級結(jié)構(gòu)的預測分析。利用PredictProtein分析家蠅BG酶基因的功能位點。最后，利用ExPASy中的3D-pssm(Phyre Version 0.2)模建家蠅BG酶基因的三維空間結(jié)構(gòu)圖。

1.2.8原核表達體系與鑒定

1.2.8.1 家蠅BG酶基因成熟肽引物的設(shè)計與合成

根據(jù)家蠅BG酶肽序列和大腸桿菌的表達載體pET-28a(+)多克隆位點，用Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計。上游引物MDbg-F，含有EcoRI酶切位點及保護堿基；下游引物MDbg-R,含有XhoI酶切位點及保護性堿基，引物均委托上海生工技術(shù)有限公司合成。用EcoRI和XhoI酶對pET-28a(+)載體及含目的DNA片段的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將上述回收的pET-28a(+)線性載體質(zhì)粒與從pMD19-T切下來的重組質(zhì)粒用T4-DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定后，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并送質(zhì)粒至TaKaRa公司測序。

1.2.8.2 的pET-28a(+)-bg-1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌感受態(tài)細胞

分別取兩種重組質(zhì)粒10 μL加入到100 μL的E.ColiBL21感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含25 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-14 h。挑取陽性克隆后搖菌培養(yǎng)12 h后，用引物MDbg-F和MDbg-R進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送到上海生物技術(shù)有限公司進行測序。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為的pET-28a(+)-bg-1-BL21/DE。

1.2.8.3 重組蛋白的誘導表達

取的pET-28a(+)-bg-1-BL21于卡那霉素抗性平板上劃單克隆，37℃培養(yǎng)過夜。挑單克隆菌落接種于5 mL含有50 μg /mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，將空表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌中，做為陰性對照，同時做空宿主菌的空白對照。加IPTG至終濃度為1 mmol/L進行誘導表達。將重組菌單克隆按上述方法接種擴大培養(yǎng)，按照HisTag融合蛋白純化操作手冊進行純化，濃縮蛋白通過SDS-PAGE鑒定并使用分光光度計測定濃度，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9重組家蠅BG酶的活性鑒定

采用七葉苷平板顯色法:I液：稱取4 g瓊脂置于100 mL，pH值5.6，0.2 mol/L醋酸一醋酸鈉緩沖溶液中，高溫滅菌20 min，冷卻至55 ℃。II液：新鮮配制含質(zhì)量濃度0.2 g七葉靈和0.6 g FeCl3。用ddH2O定容至100 mL后，水浴加熱到50℃。將以上2種溶液混合并立即到入培養(yǎng)皿中，制備平板。冷卻，打孔(孔徑為0.3-0.6 cm，相互間的兩孔距離要適宜)，分別將稀釋相應濃度的100 μL重組蛋白加入到小孔中。封好培養(yǎng)皿，置于37℃培養(yǎng)箱中保溫48 h后，觀察顯色反應。

1.2.10重組家蠅BG酶融合蛋白底物特異性

采用DNSA法測定，在離心管中分別加入1%水楊苷、2%乳糖、30 Mm纖維二糖、1%蔗糖、1%麥芽糖、1%羧甲基纖維素鈉、1%微晶纖維素90 μL后加入30 μL重組蛋白，混勻后在50℃水浴條件下反應60 min，立即加入0.3 mL DNSA顯色劑終止反應，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1 M醋酸-醋酸鈉緩沖液定容至5 mL。設(shè)陰性對照(以緩沖液代替酶液)。于紫外分光光度計測OD540值，每一個樣品3個生物重復，每組做3個重復。計算方法與按照文獻進行計算(張姝等，2013)。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡并引物設(shè)計和保守區(qū)域的擴增

將篩選出的32對簡并引物進行PCR擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳，其中有1對引物(表1)的擴增產(chǎn)物特異性最好。電泳結(jié)果顯示其片段大小約為402 bp，與預計相符，無非特異性條帶出現(xiàn)(圖1)。將該片段進行雙向測序，測序結(jié)果進行BLAST比對，顯示該序列屬于糖苷水解酶第一家族，與草地貪夜蛾、大紅斑蝶、黑翅大白蟻、臺灣乳白蟻、黃粉蟲、馬德拉蜚蠊β-葡糖苷酶氨基酸序列的同源性較高，達到70%以上。因此認定在家蠅體內(nèi)成功克隆了BG酶基因的保守區(qū)域。

表1 篩選出上下游引物

注：引物由5′端非簡并夾板區(qū)(大寫字母)和3′端核心簡并區(qū)(小寫字母)組成。其中R=A/G，Y=C/T， S=C/G， V=A/C/G。Note：The primer is constituted by 5′non-degenerate consensus clamp(capital letters)and 3′degenerate core(lowercase letter)，R=A/G，Y=C/T， S=C/G， V=A/C/G.

圖1 家蠅BG酶基因保守區(qū)域PCR的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 The conserved domain of Musca domestica BG gene注：1，陰性對照；2，家蠅BG酶基因保守區(qū)域PCR產(chǎn)物；3，DL2000 DNA 分子標準。Note：1， negative control.； 2，the conserved domain of M.domestica BG gene；3， DL2000 DNA Marker.

2.2 家蠅BG酶的3′RACE

家蠅3齡幼蟲采用Clonetech SMART RACE cDNA Kit經(jīng)過2次PCR反應后，擴增引物見(表2)，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測在1000 bp和2000 bp之間可見一條明顯的特異性條帶(圖2)，經(jīng)測序鑒定為1475 bp核苷酸序列。用DNAman和NCBI中Blast軟件將3′RACE所得序列與家蠅保守區(qū)域序列進行拼接和比對，有連續(xù)的117 bp核苷酸序列與保守區(qū)域的序列重合。因此認為通過上述實驗方法在家蠅幼蟲體內(nèi)成功獲得了家蠅β-葡糖苷苷酶基因的3′末端片段。

表2 家蠅β-葡萄糖苷酶cDNA擴增過程中所用引物

圖2 家蠅BG酶3′RACE產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The conserved domain of Musca domestica BG gene 3′RACE注：1，第一次PCR產(chǎn)物；2，第二次PCR產(chǎn)物； 3， DL2000 DNA分子標準。Note：1,3′RACE product of the first PCR; 2, 3′RACE product of the sond PCR;3, Maker DL2000.

2.3 家蠅BG酶基因的5′RACE

進行兩輪擴增，擴增引物見(表2)，在315 bp處獲得一特異性條帶(圖3)。經(jīng)測序鑒定為315 bp核苷酸序列。運用NCBI對該cDNA序列進行Blast分析, 測序結(jié)果顯示的該序列具有起始密碼子為完整的5′端序列。用DNAman和NCBI中Blast軟件將5RACE所得序列與家蠅BG保守區(qū)域的序列進行拼接和比對，有73個核苷酸與保守區(qū)域序列完全吻合。因此認為成功獲得了家蠅BG酶基因的5′末端片段。

圖3 家蠅BG酶5′RACE產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of 5′RACE product注：1，第二次PCR產(chǎn)物；2，MakerDL-2000分子標準； 3，第一次PCR產(chǎn)物。Note：1, 5′RACE product of the first PCR; 2，Maker DL2000；3，5′RACE product of the sond PCR.

2.4 家蠅BG酶基因的全長cDNA

用軟件將家蠅BG酶基因保守區(qū)域、5′端和3′端序列進行序列拼接，去除重復區(qū)域，獲得全長cDNA序列為1933bp。該基因在5′非翻譯區(qū)中有34個核苷酸，緊接著為1689個核苷酸的開放性閱讀框(ORF),其中起始密碼子ATG位于35-37 bp，終止密碼子TAA位于1721-1723 bp，隨后為210個核苷酸的3′非翻譯區(qū)，最后為21個核苷酸的ployA尾巴。ORF編碼562個氨基酸。以家蠅3齡幼蟲總RNA為模板擴增家蠅BG酶基因完整cDNA，擴增引物見(表2)，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，在2000 bp附近有特異條帶出現(xiàn)(圖4)，測序得到1689 bp的核苷酸序列，與軟件分析全長cDNA序列一致，與其它昆蟲BG酶同源性很高。證實成功獲得了家蠅BG酶基因。將其登錄到GenBank，獲得登錄號：JX460804。

圖4 家蠅BG酶全長cDNA擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Aganrose gel electrophoresis of product from BG gene注：1，陰性對照；2，家蠅bg-1基因；3，DL2000分子標準。Note：1，negative control. 2，Musca domestica bg-1 gene; 3， DL2000 DNA Marker.

2.5 家蠅BG酶基因核酸序列及其所編碼氨基酸序列的生物信息學分析

2.5.1家蠅BG酶蛋白的基本性質(zhì)分析

運用ExPASy中ProtParam進行蛋白質(zhì)性質(zhì)分析顯示，家蠅BG酶成熟肽的理論分子量為65020.6 Da，等電點為8.16，原子總數(shù)為9038，分子式為C2941H4441N801O835S20，在組成的家蠅BG酶的氨基酸中，絲氨酸Ser所占比例最高，達到8.0%，其次是亮氨酸Leu(7.5%)、甘氨酸Gly(6.9%)、精氨酸 Arg(6.4%)、天冬酰胺Asn(5.9%)、纈氨酸val(5.7%)，半胱氨酸Cys所占比例最低，為0.5%，帶正電荷為59，負電荷為61，消光系數(shù)為142795，蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期大于20h。脂肪族指數(shù)：76.83，為親水性蛋白。運用BioEdit作蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域分析顯示，在N端位置有一個典型的疏水性區(qū)域，大約在540-

560位氨基酸之間。運用ExPASy中的TMpred對家蠅BG酶氨基酸序列進行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，該蛋白可能有兩個跨膜區(qū)域，在該蛋白的第1至27個氨基酸內(nèi)，出現(xiàn)較弱的跨膜信號，方向由膜內(nèi)向膜外，在第541至561位氨基酸出現(xiàn)較強的跨膜信號，方向由膜外向膜內(nèi)。用singIP 4.0分析可見，家蠅BG酶蛋白具有信號肽，且剪切位點可能位于第28與第29位氨基酸之間。與跨膜區(qū)域分析的結(jié)果相吻合。用TargetP進行亞細胞定位分析可見，目的蛋白是在胞內(nèi)合成后分泌到胞外(圖5-圖6)。

2.5.2家蠅BG酶的二級結(jié)構(gòu)分析

采用ExPASy的Smart數(shù)據(jù)庫對家蠅BG酶基因成熟肽的結(jié)構(gòu)域進行分析，其功能結(jié)構(gòu)域可能是第32位氨基酸和第501位氨基酸之間的序列。利用Prosite預測蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)功能位點，發(fā)現(xiàn)其在位點329-337(VYVTENGVS)處含有糖基水解酶家族 1(GHF-1)的功能位點。通過YinOYangV1.2分析其可能的O-糖基化位點分別為；Thr 26，Ser 126，Ser 266，Thr 300，Thr 348，Thr 378，Thr 411，Thr 484，Thr 525，Thr 526，Ser 527，沒有發(fā)現(xiàn)N-糖基化修飾(圖7-圖8)。

圖5 SignalP 4.0分析結(jié)果Fig.5 SignalP 4.0 output for bg-1 gen

圖 6 TargetP1.1 Server 亞細胞定位結(jié)果Fig.6 Subcellular loction of TargetP 1.1 Server

圖7 家蠅BG酶二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果Fig.7 The sondary structure prediction for Musca domestica BG

圖8 家蠅BG酶三級結(jié)構(gòu)Fig.8 The tertiary structure prediction for Musca domestica BG

2.6 家蠅pET-28a(+)-bg-1的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pET-28a(+)-bg-1經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，獲得兩條條帶，一條約1605 bp 的目的條帶，和目的條帶相符，一條約為5369 bp，與pET-28a(+)質(zhì)粒的大小相符(圖9)，重組質(zhì)粒的測序結(jié)果也顯示目的基因以正確的讀碼框插入到pET-28a(+)載體中，且擴增均無任何突變。重組表達質(zhì)粒含有6個組氨酸編碼序列，表明重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-bg-1 構(gòu)建成功。

圖9 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-bg-1 雙酶切鑒定Fig.9 Restriction enzyme digestion identification of pET-28a(+)-bg-1注：1，重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-bg-1 雙酶切鑒定結(jié)果； 2，陰性對照；3，MarkerⅢ DNA分子標準。Note：1，The enzyme digestion product of pET-28a(+)-bg-1 by EcoRⅠand XholⅠ； 2， negative control； 3，MarkerⅢ DNA Marker.

2.7 pET-28a(+)-bg-1融合蛋白在大腸桿菌中的表達

重組家蠅pET-28a(+)-bg-1轉(zhuǎn)入BL21(DE3)后，在37℃，1mmol/L IPTG誘導4h后進行SDS-PAGE電泳，與pET-28a(+)空載轉(zhuǎn)化菌組、pET-28a(+)空載誘導組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌未經(jīng)IPTG誘導組為對照，在66 kDa與45 kDa有明顯的條帶，與目的條帶(BG酶基因成熟肽分子量與His標簽分子量之和)的大小相符，表明家蠅BG酶基因在大腸桿菌中穩(wěn)定的表達。且重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)裂解后的上清中有可溶性的重組BG酶融合蛋白，包涵體中也有大量重組BG酶融合蛋白的表達(圖10)。

圖10 重組BG酶融合蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.10 SDS-PAGE analysis of the BG fusion protein注：1，蛋白分子量標準； 2，pET28a(+)未誘導； 3， pET28a(+)誘導； 4， 重組蛋白未誘導；5，大量誘導表達后菌液沉淀；6，大量誘導表達后菌液上清 7， 純化的MDBG-1蛋白； 8，未經(jīng)誘導的BL21全菌液； 9，經(jīng)誘導表達后的BL21全菌液. Note：1，Protein Marker； 2， pET-28a(+) trantformants without IPTG induction;3， pET-28a(+) trantformants with IPTG induction;4， Supernatant of pET-28a(+)-bg-1without IPTG induction； 5，Supernatant of pET-28a(+)-bg-1 induced by IPTG； 6， Precipitation of pET28a(+)-bg-1 induced by IPTG； 7， Purified fusion protein of pET28a(+)-bg-1；8， pET-28a(+)-bg-1 trantformants without IPTG induction；9， pET-28a(+)-bg-1 trantformants with IPTG induction.

2.8 重組家蠅BG酶的活性鑒定和底物特異性

將重組家蠅BG酶加入醋酸-醋酸鈉緩沖液進行稀釋，并各取100 μL分別加入七葉苷固體平板培養(yǎng)基的小孔中，至37 ℃培養(yǎng)箱24 h后，出現(xiàn)黑色的透明圈。由此可見，其是具有β-葡萄糖苷酶活性的重組蛋白。通過DNS顯色法檢測到兩種原核表達體系表達的融合蛋白均具有BG酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶三種酶活性(表3)。

表3 原核表達體系對不同底物的酶活性

3 結(jié)論與討論

家蠅，家蠅科、家蠅屬，屬于雙翅目，其分布廣泛，雜食性，極強的環(huán)境適應性，其與環(huán)境中木質(zhì)纖維素接觸密切，可以通過內(nèi)源性纖維素酶(胡蓉等，2013)消化纖維素作為食物來源，為自身提供能量。在陸生植物纖維素的生態(tài)循環(huán)和生物轉(zhuǎn)化中做出貢獻的同時也成為了傳播疾病的主要媒介昆蟲。因此對家蠅內(nèi)源性纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)進行研究，不但可以深入闡明家蠅適應復雜孳生環(huán)境的生理基礎(chǔ)和生態(tài)功能，而且有望通過對家蠅纖維素酶基因進行分子改造或沉默從而使家蠅纖維素酶活性受抑或喪失，為家蠅生態(tài)控制提供新的途徑(張姝等，2013)。

BG酶作為纖維素酶系的限速酶，在昆蟲消化纖維素的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明幾乎所有的昆蟲體內(nèi)都具有BG酶，僅是由于生存環(huán)境的改變，BG酶基因就可能被抑制或沉默(Hirofumi Watanabe and Gaku Tokuda，2010；Sharmaetal.， 2016)，同時對目前已知的昆蟲BG酶基因序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其在昆蟲的種屬間存在很高的同源性，較為保守(Shelomietal.， 2016；Zhouetal.， 2016)。根據(jù)這一特點，人們進一步發(fā)現(xiàn)和證實其它昆蟲也具有BG酶基因，因此本課題以它作為研究家蠅纖維素酶的突破口并展開研究。

早期對BG酶的克隆是通過構(gòu)建cDNA文庫進行活性篩選的方式獲得的。隨著PCR技術(shù)的應用，利用種屬保守區(qū)域進行擴增，成功克隆了許多BG酶基因(Junetal.，2016；朱世馨等，2016)。本研究采用程序化設(shè)計簡并引物的方法，先將數(shù)據(jù)庫(NCBI)上找到的若干與家蠅親緣關(guān)系較近的昆蟲BG酶氨基酸序列進行BlockMaker，得到其連續(xù)氨基酸序列保守區(qū)后再用CODEHOP設(shè)計多條簡并引物，通過夾板區(qū)溫度進行篩選，再使用生物軟件DNAMAN對上、下游引物的匹配情況進行二次篩選，之后再利用Oligo 6.0對引物進行發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度第三次篩選和分析獲得最合適的引物對。此法所設(shè)計的簡并引物簡并度相對較低，Tm值較高， 獲得PCR產(chǎn)物特異性增加，假陽性率低，本實驗擴增出來的產(chǎn)物進行電泳，未出現(xiàn)非特異的條帶。為下一步的實驗成功奠定扎實的基礎(chǔ)。再結(jié)合RACE-PCR的方法，成功克隆了家蠅的BG酶基因序列，有助于在分子水平上對家蠅BG酶的結(jié)構(gòu)和作用機制進行分析，同時為后續(xù)重組表達家蠅BG酶提供了可能，也為今后的定向進化等技術(shù)手段提高酶的活性或者改進酶的催化性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

大腸桿菌Escherichiacoli表達系統(tǒng)是第一個用于重組蛋白的表達系統(tǒng)，同時也是應用最為廣泛的經(jīng)典表達系統(tǒng)。它通過全基因組測序，具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、遺傳穩(wěn)定，生長周期短，成本低，可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點，因而被美國FDA批準為安全的基因工程受體菌。本研究對已克隆家蠅BG基因進行大腸桿菌異源表達，構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建了家蠅BG酶的高效、穩(wěn)定的原核表達載體，通過IPTG誘導，得到了相對分子質(zhì)量為65 kDa的重組BG酶。對了解家蠅BG基因結(jié)構(gòu)的完整性，生物學信息推導結(jié)果的正確性進行驗證，有益于對家蠅BG基因在適宜的宿主中進行表達以及基因改造等提供技術(shù)儲備。

BG酶根據(jù)底物特異性分為三類：第一類BG酶專一性地水解芳香基糖苷,如對-硝基-β-D-葡萄糖苷等類似物。第二類β一葡萄糖普酶專一性地水解纖維二糖,也叫纖維二糖酶。第三類β一葡萄糖苷酶能夠水解多種糖苷類衍生物以及纖維二糖、纖維寡糖等,稱為廣底物型β一葡萄糖苷酶(Margollesetal.， 1997；Vrieetal.，1999；Strickeretal.， 2008)。第三類β一葡萄糖苷酶能裂解C-O糖苷鍵，C-S鍵，C-F鍵等，對底物的糖基部分結(jié)構(gòu)專一性較低，但對所有底物中，BG酶對纖維二糖的活性是最強。家蠅BG酶融合蛋白的酶底物特異性實驗顯示其能夠水解纖維二糖、乳糖、蔗糖等，證實其是一種廣底物型BG酶，廣泛的底物范圍以及特殊的底物水解能力使其具有非常好的工業(yè)應用前景。在研究中，發(fā)現(xiàn)家蠅BG酶蛋白除了具有BG酶活性以外，還具有水解羧甲基纖維素鈉和微晶纖維的能力。這說明家蠅BG酶隨著對棲息環(huán)境和取食特性的適應,進化成了一個多功能的纖維素酶，在沒有其他兩種纖維素酶參與下完成纖維素降解或進一步增強家蠅纖維素酶體系對纖維素水解能力。

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Cloningandrecombinantexpressionofβ-glucosidasegenefromMuscadomestica

ZHANG Shu1, HU Rong2, HUANG Jian1*,WU Jian-Wei2*, GUO Guo2，F(xiàn)U Ping2，XIU Jiang-Fan2，SANG Xiao-Li2

(1. Department of Clinical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004,China；2. Department of Parasitology, Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Endogenous β-glycosidase (BG) gene ofMuscadomesticawas cloned to construct a prokaryotic expression system, and the activities of expression products were detected. The characteristics of endogenous BG were explored to provide molecular and biological bases for further explaining the strong adaptive capacity ofM.domesticato the environment and taking new measures for population control. Using the BG gene sequences of 6 representative, well-studied insects such asSpodopterafrugiperdaas references, the whole-length cDNA sequence of BG gene that was cloned from cDNA ofM.domesticawas subjected to bioinformatics analysis by homology-based cloning in combination with RACE-PCR. Afterwards, pET-28(+) vector was used to construct a prokaryotic expression system that was transformed intoE.coliBL21/DE to induce expressions of recombinant proteins. The BG activities of different recombinant proteins were detected by the aesculin plate method and DNS method, and their characteristics were preliminarily analyzed. Whole-length cDNA sequence (1933 bp) of BG gene was cloned fromM.domestica, and deduced to be a polypeptide comprising 562 amino acid residues. After induced expression of recombinant prokaryotic plasmid, a specific band appeared at about 65 kDa, verifying that the recombinant plasmid was successfully expressed. The recombinant BG ofM.domesticasimultaneously had the activities of endo-β-1,4 glucanase (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase (EC 3.3.1.91) and BG (EC 3.2.1.21). BG fromM.domesticais a novel multifunctional cellulase, as an important supplement for studies on inst cellulases.

Muscadomestica；β-glucosidase；clone; heterogenous express；enzymatic activity.

貴州省教育廳培育項目[(2009)0137];國家科技支撐計劃課題(2011BAC06B12)；國家自然科學基金(30960343)；國家教育部博士點專項基金[(2008)220]

張姝，女，1980年生，博士，副教授，研究方向為昆蟲免疫學，E-mail:418611579@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail:31712463@qq.com

Received: 2017-05-22; 接受日期Accepted: 2017-07-14

Q963;S433.89

：A

1674-0858(2017)04-0930-10

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