磁小體膜蛋白Mms6功能與應(yīng)用研究進展

馬坤趙宏鑫，2李倩王嘉榕孫紅賓

（1. 中國科學(xué)院強磁場科學(xué)中心，合肥 230031；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院，合肥 230031）

磁小體膜蛋白Mms6功能與應(yīng)用研究進展

馬坤1趙宏鑫1，2李倩1王嘉榕1孫紅賓1

（1. 中國科學(xué)院強磁場科學(xué)中心，合肥 230031；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院，合肥 230031）

磁小體是趨磁細菌的內(nèi)膜內(nèi)陷形成的一種特殊生物礦化產(chǎn)物。磁小體在細胞內(nèi)呈現(xiàn)為鏈狀，外部有一層生物膜包裹，內(nèi)部是四氧化三鐵納米晶體。這些磁性納米晶體有著高度均一的尺寸和形貌。目前大量研究結(jié)果表明磁小體膜上的蛋白與鐵離子的富集、氧化還原反應(yīng)以及晶體成核、生長有著重要的關(guān)系。綜述了趨磁細菌從吸收鐵離子到礦化形成磁性納米顆粒過程中，磁小體膜蛋白的功能，重點介紹了六號特殊膜蛋白Mms6的結(jié)構(gòu)特性與功能。同時總結(jié)了Mms6作為一種仿生的添加劑在新型磁性納米材料中的應(yīng)用，并且討論了Mms6在磁小體形成中可能的分子調(diào)節(jié)機制，旨為進一步了解生物礦化機制提供思路。

磁小體；生物礦化；Mms6蛋白；仿生材料合成

磁性納米材料對于藥學(xué)和診斷醫(yī)學(xué)的發(fā)展有著重要的意義，如應(yīng)用于磁共振成像的造影劑，細胞分離、環(huán)境檢測、疫苗藥物輸送和磁熱效應(yīng)等方面［1-6］。磁性納米材料能夠在生物醫(yī)學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域興起，最重要的原因是磁性納米材料在磁場下能夠快速、準(zhǔn)確地到達靶點或者將修飾后的目的分子分離出來，并且生物毒性低［7］。隨著社會的高速發(fā)展，高科技領(lǐng)域?qū)τ诖判圆牧系囊笤絹碓礁?，而磁性納米材料的尺寸與形貌直接影響其質(zhì)量，所以發(fā)展一種產(chǎn)量高、均一性好的磁性納米材料合成方法是當(dāng)今的熱點。目前主要化學(xué)合成磁性納米材料的方法各具特色［1］，但是都無法同時具備產(chǎn)量大、環(huán)境友好、產(chǎn)出的磁性納米材料形貌均一的優(yōu)點。而生物界卻給磁性納米材料的合成提供了一個很好的提示［5，8-10］。

生物體中天然存在的磁性納米顆粒（Fe3O4），最早發(fā)現(xiàn)于海洋中的一些無脊椎動物的牙齒中，這種材料幫助它們從巖石上取食藻類。接著科學(xué)界又在蜜蜂、魚類、鳥類等生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)天然形成的磁性納米晶體［8，11］。盡管這些生物體內(nèi)磁性納米晶體的形成機制不明確，但是科學(xué)家們推測這些磁性納米晶體功能類似于指南針，通過地磁場來幫助生物體確定所在位置［12］。在微生物界中，趨磁細菌是一種典型的生物礦化生物，其體內(nèi)形成磁性納米顆粒鏈促使菌體順著地磁場進行遷移運動。這些磁性納米晶體外面都包裹著一層生物膜，統(tǒng)稱為磁小體。磁小體約由20-50個晶體顆粒組成，晶體粒徑在30-100 nm之間。趨磁細菌形成磁小體的生物礦化的過程被嚴格調(diào)控，使得磁小體納米晶體的數(shù)量、尺寸和形態(tài)高度統(tǒng)一［4，7-8，13］。目前對于趨磁細菌生物學(xué)的研究使人們進一步明確磁小體納米晶體形成的分子機制，并且進一步拓展磁性納米材料在生物材料領(lǐng)域中的應(yīng)用。本文綜述了磁小體膜蛋白Mms6的結(jié)構(gòu)特性以及在磁小體形成中可能的分子調(diào)節(jié)機制，并且總結(jié)了Mms6作為一種仿生的添加劑在新型磁性納米材料中的應(yīng)用，旨為進一步了解生物礦化機制提供思路。

1 磁小體形成過程及相關(guān)膜蛋白

目前普遍認為磁小體是分步形成的，并且是由多種基因參與調(diào)控。第一步，趨磁細菌細胞膜內(nèi)膜內(nèi)陷為一個內(nèi)腔，形成磁小體膜（Magnetosome menbrane，MM），為磁小體的生成提供一個無氧氣環(huán)境。內(nèi)腔沿著細胞骨架的方向不斷的延伸，最后組裝形成了一條鏈。第二步，游離的二價鐵離子通過跨膜蛋白MagA等將其運輸?shù)絻?nèi)腔中。第三步，聚集的鐵離子通過部分的氧化還原在腔體內(nèi)成核，最后生長成磁性晶體［14-15］。腔體內(nèi)多種膜蛋白共定位在磁小體膜上，參與調(diào)控生物礦化（圖1）。這些膜蛋白按照功能分為：鐵離子輸運蛋白（MagA等）、氧化還原蛋白（MamP等）、磁小體成鏈蛋白（MamY、MamK等）和調(diào)控晶體蛋白（MamA、Mms6等）［16-19］。其中，氧化還原蛋白是磁小體形成的化學(xué)基礎(chǔ)，調(diào)控晶體蛋白是調(diào)控磁小體的成核和晶體生長的重要蛋白［16，19］。

MamY是一種膜嵌入蛋白，其N端有兩段區(qū)域嵌入到膜中，蛋白C端是一個較大胞內(nèi)的功能域。Tanaka 等［20］通過敲除mamY 基因發(fā)現(xiàn)，突變株的磁小體腔體變大，而磁小體納米晶體變小，又通過熒光MamY-GFP 共定位方法方法發(fā)現(xiàn)，MamY在磁小體內(nèi)膜中緊密貼附在磁小體上。這些結(jié)果都暗示了MamY功能是通過調(diào)控磁小體腔體的大小，從而調(diào)控晶體的尺寸。MamA是近膜四聚體蛋白，具有34個殘基組成的重復(fù)的結(jié)構(gòu)域（TPR motifs），是趨磁細菌中最保守的磁小體膜蛋白。TPR結(jié)構(gòu)域的功能是促進蛋白與蛋白之間的相互作用，使相關(guān)蛋白的富集［21-22］。MamA缺失突變株中［21］，細胞膜的內(nèi)陷和晶體的形成都沒有受到影響。通過MamAGFP補償表達發(fā)現(xiàn)，MamA蛋白定位在磁小體鏈上。Zeytuni等［22］通過對MamA蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析表明，MamA蛋白的TPR區(qū)域折疊形成鉤狀結(jié)構(gòu)。它的功能類似于腳手架蛋白，能夠與磁小體膜上Mms16、MspA等蛋白相互作用與提供細胞膜內(nèi)陷的位點。MagA是一種跨膜蛋白，具有離子泵的功能泵進鐵離子，泵出氫離子功能［23］。MamM與MamB蛋白是一種陽離子擴散促進器（Cation diffusion facilitator，CDF）家族蛋白，其結(jié)構(gòu)中有6個高度保守跨膜螺旋，蛋白的N端與C端都在胞內(nèi)。這類家族蛋白是一種多功能蛋白，除運送鐵離子的功能外，還可以參與晶體形成的調(diào)節(jié)，并且能通過自身PDZ（GLGF 重復(fù)序列）結(jié)構(gòu)與與其他膜上的蛋白相互作用，調(diào)節(jié)其他磁小體膜蛋白的活性［17］。MamP蛋白是鐵離子的氧化還原的蛋白，其蛋白N端是跨膜區(qū)段，蛋白C端擁有兩個類似于細胞色素C的結(jié)構(gòu)域，并且也具有PDZ的結(jié)構(gòu)。MamP主要功能是將富集的三價鐵離子還原成二價鐵離子［24］。MamK是一種類肌動蛋白，功能是促使磁小體內(nèi)腔生成細絲，調(diào)控磁小體形成鏈狀結(jié)構(gòu)［25-26］。MamJ是一種酸性蛋白質(zhì)，與MamK相互作用，共同調(diào)控磁小體鏈狀物生成［26-27］。

圖1 磁小體形成過程預(yù)測模型［7］（左）與成熟無膜磁小體（右）（本課題組實驗結(jié)果）

2 磁小體特殊膜蛋白Mms6研究

2.1 Mms6在趨磁細菌體內(nèi)的功能

研究表明趨磁細菌基因組上4種操縱子mms6、mamGFDC、mamAB和mamXY參與調(diào)控磁小體納米晶體尺寸、形貌［19，28］。Arakaki和Kolinko等［28-29］實驗發(fā)現(xiàn)缺失這些基因，趨磁細菌將失去形成磁小體的能力，而將這些基因簇整合到其他種類細菌中，這些細菌具有了產(chǎn)生磁小體的能力。其中mms6基因表達的Mms6蛋白在調(diào)控晶體形貌中起到至關(guān)重要的作用。Mms6是由日本科學(xué)家Arakaki 等［30］發(fā)現(xiàn)，他們通過去掉磁小體膜，暴露出磁小體納米晶體，再使用高溫處理，釋放出了結(jié)合在磁小體納米晶體上的Mms6蛋白。

Mms6蛋白有著很高的保守性，其特征是蛋白序列有一段疏水N端和一段親水的C端，且N端有重復(fù)的GL序列，在pH中性的狀態(tài)時蛋白帶負電，并且僅存在于磁小體膜上，其他生物膜體系中未曾發(fā)現(xiàn)［30］。Mms6理論上表達出的蛋白分子量應(yīng)為15 kD，遠大于直接從磁小體上分離出的6 kD。Arakaki［30］認為原始的Mms6蛋白的N端類似于信號肽，被特殊的酶剪切，形成成熟的Mms6蛋白。Tanaka等［19］將趨磁細菌的mms6基因敲除后發(fā)現(xiàn)，磁小體納米晶體形態(tài)變窄變長，尺寸的均一性降低，平均晶體直徑有接近44%的減小，而野生株和回補mms6基因的突變株形成的磁小體，形狀和尺寸是十分統(tǒng)一的。值得一提的是，Murat等［31］構(gòu)建的mms6缺失株的晶體與野生株平均直徑差異只有19%。造成兩個課題組實驗結(jié)果的差異的原因，可能是由于二者敲除基因的方法不一樣。Tanaka等使用抗生素DNA序列組件取代了mms6基因，而Murat等使用的兩步重組法敲除mms6基因，插入的抗生素DNA序列組件可能會影響到下游基因的表達，間接影響到磁小體的形成。Tanaka等的高分辨電子透射顯微鏡（TEM）結(jié)果表明，野生株的磁小體納米晶體的長、寬比值接近1.0，具有（100）與（111）晶面，但是缺失株中的磁小體納米晶體的長寬比值是0.75，且只有（210）、（211）、（311）晶面。他們認為突變株的磁小體（110）晶面的能量過高從而導(dǎo)致晶體不穩(wěn)定，拉長晶體的長度，最終形成長條形。以上的研究結(jié)果都暗示了Mms6蛋白可能識別磁性納米晶體表面從而調(diào)控晶體的生長。

2.2 Mms6在體外的構(gòu)象

Mms6蛋白具有兩親性，在體外水環(huán)境狀態(tài)下蛋白的疏水區(qū)域會自行組裝團聚在一起，形成親水性C末端在外，疏水性N端在內(nèi)部的微囊狀態(tài)（micelle）。Wang等［32］使用分子篩的方法得到了自組裝成micelle的Mms6，分子量為400 kD，約由20-40個蛋白團聚形成。通過分子篩估算出Mms6 micelle的粒徑與Amemiya等［33］的動態(tài)光散射（DLS）的實驗結(jié)果一致，平均粒徑為10.2±3 nm。Zhang等［34］使用小角衍射（SAXS）的方法計算得到Mms6 micelle的親水端的的長度約為1.1±0.2 nm，并且加入一定量的鐵離子后，促使較小的micelle聚集形成一個有規(guī)則圓盤形態(tài)。Kashyap等［35］通過原位透射電鏡觀察到鐵離子與Mms6相互作用并且富集在其表面的過程。值得一提的是實驗中Mms6 micelle在電鏡中顯示出的粒徑很大，甚至接近了原來粒徑10倍，約為100 nm，推測是鐵離子聚集在表面形成沉淀導(dǎo)致粒徑變大。本課題組［36］通過高分辨率液體核磁共振（NMR）技術(shù)得到了Mms6與Mms6的C末端的25殘基在體外狀態(tài)下的核磁光譜，結(jié)果表明二者的光譜極為相似，并且Mms6光譜中只有C末端的17個殘基顯示出信號。我們認為Mms6的N端緊密包裹導(dǎo)致了沒有任何N端殘基信號出現(xiàn)，而Mms6的C末端才是蛋白主要的功能區(qū)域。以上實驗結(jié)果都證明Mms6在體外自組裝形成micelle，并且只有少量的C末端親水性殘基暴露在micelle表面。

2.3 Mms6蛋白調(diào)控磁性晶體形成的機制

Mms6蛋白調(diào)控磁小體納米晶體的具體分子機制至今仍然不明確。從目前的研究進展看，科學(xué)界普遍認為Mms6蛋白C末端對磁小體納米晶體成核、晶體生長有重要作用［30，37-38］。Mms6的C末端富含酸性氨基酸，表面呈現(xiàn)出負電。Arakaki等［30］發(fā)現(xiàn)Mms6可以與Fe3+，Ca2+和Mg2+相互作用，卻不與Zn2+、Ni2+和Cu2+相互作用。Wang等［32］使用分子篩的方法，得出Mms6與鐵離子有著強烈的結(jié)合（Kd=10-16mol/L），而且獨立的Mms6的C末端21個殘基（Mms6C21）也具有與鐵離子結(jié)合的能力。但是將C末端酸性氨基酸突變?yōu)閴A性，Mms6幾乎沒有與鐵離子結(jié)合能力。Rawlings［39］最新的研究表明，Mms6C20是通過與二價鐵離子相互作用推遲了磁性晶體成核，而基本不與三價鐵離子相互作用，其中Mms6的C末端的DDVED的區(qū)段為與鐵離子結(jié)合位點。Yamagishi等［40］將趨磁細菌體內(nèi)Mms6的部分氨基酸殘基缺失突變，通過高分辨電子透射顯微鏡結(jié)果來確定Mms6蛋白哪些殘基對磁小體形貌起到關(guān)鍵作用。結(jié)果表明當(dāng)Mms6的N端或者C末端特別是DEEVE區(qū)域缺失突變后都嚴重影響了磁小體形成正常的形貌。這些結(jié)果都暗示Mms6具有選擇性結(jié)合金屬離子的功能，并且通過與這些離子螯合推遲了晶體成核，達到調(diào)控晶體形貌的功能。2.4 Mms6蛋白在磁性納米材料合成中的應(yīng)用

磁性納米材料的尺寸和形貌決定了其物理特性，直接影響到材料的應(yīng)用［1］。目前較為成熟的合成磁性納米方法有以下幾種：水熱法、高溫分解法和共沉淀法（表1）。高溫法、水熱法產(chǎn)出的磁性納米晶體有著均的尺寸和形貌，但是產(chǎn)量較低，而且反應(yīng)條件（要求高溫高壓，大量有機溶液體系）對環(huán)境污染巨大。共沉淀法要求技術(shù)條件簡單，并且水溶液體系對環(huán)境污染較小，但是缺點是無法調(diào)控形成晶體的形貌。

而利用Mms6模擬生物條件，參與磁性納米材料合成，可以提高晶體尺寸和形貌的均一性。Arakaki和Prozorov等［30，33，41］將適量Mms6加入鐵離子的混合物中，使用共沉淀法合成出的磁性納米材料，尺寸范圍在20-30 nm之間，而沒有加入蛋白的對照組，尺寸分布較大，并且形貌不規(guī)則；Galloway和Zhang等［42-43］也利用類似的方法合成了形貌均一、矯頑力高的鈷、釓摻雜的鐵氧化物磁性納米材料（CoFe2O3、Fe（3-x）GdxO4（x=0.085±0.002））。這些結(jié)果都進一步證明Mms6可以調(diào)節(jié)磁性納米晶體的形成。Amemiya等［33］使用部分還原法合成磁性納米顆粒，通過加入適量Mms6，合成出的磁性納米顆粒也是具有較為統(tǒng)一的尺寸和形貌，粒徑大約為20 nm。值得一提的是實驗中加入Mms6組合成的晶體形貌特征是立方八面體型，包含了（111）和（100）晶面，與天然的磁小體的形貌很接近，而對未加入蛋白對照組形成的晶體是菱形八面體型，只有（111）晶面（本課題組也重復(fù)出類似結(jié)果，圖2），并且通過檢測加入Mms6組合成晶體表面，確定Mms6吸附在晶體表面，所以他們推測Mms6可以特異性結(jié)合到磁小體納米晶體的（100）晶面（圖2）。Arakaki和Oestreicher等［44-45］通過細胞熒光共定位、納米金修飾抗體等方法確認了Mms6可以與磁小體晶體直接的相互作用。本課題組［36］也通過高分辨NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)Mms6可以特異性識別磁小體晶體，并且特異性的識別位點也是DEEVE區(qū)域。這些結(jié)果進一步暗示了Mms6不僅在磁小體晶體成核中起到作用，Mms6還可以通過與磁小體晶體晶面相互作用，從而調(diào)控磁小體晶體的生長。

表1 磁性納米材料合成方法比較

圖2 Mms6調(diào)控晶體生長的機制假設(shè)（左）［33］和四氧化三鐵的高分辨透射電鏡圖（右）（本實驗室結(jié)果）

由于認為Mms6C末端是主要功能區(qū)域，所以科學(xué)家推測Mms6C末端可以模擬全長Mms6的功能。Lenders、Prozorov、Arakaki和Wolff等［10，37-38，46］將Mms6C末端超短肽加入合成體系中發(fā)現(xiàn)，合成的晶體與加入Mms6組的結(jié)果類似。Sommerdijk等［47］進一步使用隨機合成不同的堿性小肽、酸性小肽、去調(diào)控磁性納米顆粒的合成，但調(diào)控效果并不理想。近年來，科學(xué)家們認為Mms6單純作為添加劑對調(diào)控材料合成的影響是有限的，如果將Mms6固定在基地上，那么就可以更加精細、有效的調(diào)控磁性納米材料的合成。Galloway等［48］使用一種軟基底材料，通過羧基活化的聚乙烯烷硫醇（PEG-alkanethiols， PEG-COOH），與Mms6的N端反應(yīng)，將蛋白固定在一個特定平面，自組裝形成單一蛋白層（Selfassembled monolayer，SAM），使磁性納米顆粒能夠在Mms6蛋白表面上生長。Bird和Nayak等［49-51］將Mms6N端的一個殘基突變成半胱氨酸，并且更改基底為純金材料，通過激光技術(shù)，將Mms6組裝到基底的特定表面。這種新型的模板使Mms6結(jié)合效率更高，形成的SAM更加規(guī)則。通過Mms6自組裝形成SAM的模式合成出的磁性納米顆粒具有較好磁性飽和度，高矯頑力磁性并且反應(yīng)條件溫和，可應(yīng)用在數(shù)據(jù)存儲材料中［50］。

3 結(jié)語

趨磁細菌形成磁小體的生物礦化過程，是復(fù)雜的、涉及多種基因和蛋白參與的生理過程，特別是磁小體膜的內(nèi)陷與磁性納米晶體成核與生長。大量研究表明，磁小體膜上各種特異性膜蛋白MamA、MamY、MagA、MamM、MamP、MamK、Mms6和MamJ等通過相互協(xié)同調(diào)控磁小體的形成。其中Mms6是首個被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控納米晶體晶型的蛋白，在磁小體納米晶體的成核與生長過程中都起到重要的作用。隨著對Mms6的深入研究，科學(xué)界認為不能孤立研究Mms6 C端的功能，其N端的自組裝與膜的相互作用對蛋白功能也有影響［50，52］。Bird等［49］發(fā)現(xiàn)Mms6在模板上N端自組裝形成不同彎曲率micelle也調(diào)控納米晶體的形貌。本課題組［36］也發(fā)現(xiàn)Mms6的C末端短肽盡管可以與磁小體晶體有著相互作用，但這種作用沒有特異性識別。我們認為Mms6的N端疏水區(qū)域?qū)τ贛ms6蛋白在磁小體膜上的組裝排布具有重要作用，這種通過N端的疏水排布使C末端的DEEVE結(jié)構(gòu)域形成正確的取向和空間排布，實現(xiàn)對晶面的識別，達到調(diào)控磁小體晶體的功能。近年來，Mms6在生物材料領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，設(shè)計出調(diào)控效果好、成本低的人工肽取代Mms6應(yīng)用在磁性納米材料合成中，將會成為研究熱點。

盡管近幾年對Mms6研究和應(yīng)用有很大突破，但仍有問題未被解決。首先是Mms6結(jié)構(gòu)，由于Mms6自身狀態(tài)限制，目前研究結(jié)果表明Mms6在體外無蛋白構(gòu)象［36，39，49］，那么在體內(nèi)Mms6是否具有蛋白構(gòu)象；其次，Mms6蛋白調(diào)節(jié)磁性納米晶體具體分子機制仍不明確，是調(diào)節(jié)晶體成核，還是晶體生長，亦或兩者耦合在一起，這個問題仍然存在爭論。通過對這些問題的探索，人們會對生物礦化機制會有更深入了解，并且為此類蛋白在生物材料上的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Function and Application of Membrane Protein Mms6 of Magnetosome

MA Kun1ZHAO Hong-xin1，2LI Qian1WANG Jia-rong1SUN Hong-bin1
（1. High Magnetic Field Laboratory，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031；2. College of Life Sciences，University of Science and Technology of China，Hefei 230031）

The magnetosome is a special biomineralized product formed by the invagination of the magnetotactic bacteria（MTB）inner membrane. Magnetosome is composed of membrane-enclosed magnetite crystals ordered into chains along the cell. Moreover，these magnetic nanocrystals are highly homogeneous in size and morphology. The magnetosome membrane protein has been demonstrated to play an important role in the formation of magnetosome with recruitment and redox of iron and regulation of the nucleation and growth of magnetic nanocrystals. This article reviews that the main function of protein in magnetosome membrane in the process of the formation of magnetic nanoparticles from the absorption of iron ions into mineralization. Especially，the article introduces the structure characteristics and functions of the magnetosome membrane special protein 6（Mms6）. Furthermore，the article summarizes the application of Mms6，as a biomimic addictive in the new-type magnetic nanomaterials，and discusses its possible mechanism of molecular regulation during the process of the formation of magnetosome，for providing a better understanding of biomineralization.

magnetosome；biomineralization；mms6 protein；biomimeticsynthesis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0170

2017-03-07

國家自然科學(xué)基金項目（U1332142）（21372222）

馬坤，男，博士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：makun@hmfl.ac.cn

孫紅賓，男，研究員，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：hbsun@hmfl.ac.cn