李麗 趙彭年 朱希坤

（沈陽(yáng)化工研究院有限公司物與醫(yī)藥研究室，沈陽(yáng) 110021）

凍干保護(hù)劑對(duì)假單胞菌菌粉存活率的影響

李麗 趙彭年 朱希坤

（沈陽(yáng)化工研究院有限公司物與醫(yī)藥研究室，沈陽(yáng) 110021）

保護(hù)劑的添加對(duì)提高假單胞菌冷凍干燥菌粉的存活率和貯藏穩(wěn)定性有顯著效果。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)凍干保護(hù)劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化研究，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)篩選出了最佳保護(hù)劑組合：脫脂乳粉10%，山梨醇3%，甘油1%，L-抗壞血酸鈉2%，假單胞菌凍干后的存活率可達(dá)90%，菌粉25℃存放6個(gè)月，存活率為50.2%。

假單胞菌，凍干保護(hù)劑，存活率

假單胞菌生長(zhǎng)速度快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，在抑制植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)［1-6］、污染物降解［7-10］等方面具有重要的作用和應(yīng)用前景，但其對(duì)極端環(huán)境（高溫、低溫、干燥、缺營(yíng)養(yǎng)等）抵抗能力較差，干燥保藏存活率低，低存活率制約了假單胞菌的工程應(yīng)用，因此提高假單胞菌制劑收率對(duì)假單胞菌的實(shí)際應(yīng)用有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

真空冷凍干燥技術(shù)在微生物保藏方面得到了廣泛的應(yīng)用，是目前適應(yīng)性最廣的菌劑制備技術(shù)，在低溫、真空條件下，微生物的生理活動(dòng)停止，細(xì)胞活力不易受損，特別適合熱敏性、氧敏性的微生物干燥制備，且菌劑保藏中不易受污染，易于分裝運(yùn)輸。然而，由于各類(lèi)微生物菌株的生境條件、營(yíng)養(yǎng)需求、培養(yǎng)方法等存在較大差異，造成了不同微生物菌株的凍干保護(hù)劑和凍干方法也不盡相同。因此，制備假單胞菌菌粉的關(guān)鍵在于保護(hù)劑的使用。本研究旨在通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)保護(hù)劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化，得到最佳的保護(hù)劑配方，提高菌粉的存儲(chǔ)期。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的假單胞菌為本課題組選育出來(lái)的降解酚類(lèi)化合物的菌種［11］（CCTCC No.M2014400）；脫脂乳粉和食用級(jí)購(gòu)自內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)；麥芽糊精和食用級(jí)購(gòu)自山東西王糖業(yè)有限公司；甘油、甘露醇和AR購(gòu)自國(guó)藥試劑集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖和BR購(gòu)自國(guó)藥試劑集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母粉和BR購(gòu)自O(shè)XOID LTD公司；氯化鈉和AR購(gòu)自國(guó)藥試劑集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Free Zone 2.5L冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DW-86L388醫(yī)用低溫冰箱，青島海爾公司；3K-15高速離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；YXQLS-100G高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HZP-250全溫?fù)u床，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；AL204-IC電子天平，梅特勒公司。

1.2 方法

1.2.1 假單胞菌的培養(yǎng)及菌懸液制備 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L，5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

培養(yǎng)方法：將假單胞菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線，30℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，檢驗(yàn)菌株純度合格后，挑取單菌落接種到液體LB 培養(yǎng)基中（50 mL/250 mL），在30℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液。將種子液按2%接種于液體LB培養(yǎng)基中（100 mL/500 mL）培養(yǎng)48 h，在5 000 r/min 條件下離心15 min，去除上清液，用無(wú)菌生理鹽水將菌泥配制成菌懸濁液。

1.2.2 冷凍干燥保護(hù)劑的篩選 選取脫脂乳粉、葡聚糖、甘油、β-環(huán)糊精、山梨醇、抗壞血酸鈉6種保護(hù)劑［12-15］作為假單胞菌冷凍干燥保護(hù)劑的篩選對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)，選出最佳保護(hù)劑組合。

1.2.3 冷凍干燥方法 將保護(hù)劑加入裝有菌懸濁液的凍干瓶中，用勻漿機(jī)將菌液與保護(hù)劑混合均勻，于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍3 h，確認(rèn)樣品預(yù)凍完全，待真空冷凍干燥機(jī)凍干艙溫度降至-80℃時(shí)，放入預(yù)凍完全的樣品，開(kāi)始抽真空，真空冷凍干燥24-48 h后取出，獲得凍干菌粉。

1.2.4 假單胞菌存活率的測(cè)定方法 以細(xì)菌存活率表征保護(hù)劑對(duì)的保護(hù)效果，通過(guò)梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定假單胞菌活菌數(shù)，然后根據(jù)以下公式計(jì)算假單胞菌的存活率：

存活率（%）=凍干后樣品總活菌數(shù)/凍干前樣品總活菌數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 單一保護(hù)劑對(duì)假單胞菌存活率的影響

保護(hù)劑種類(lèi)及濃度見(jiàn)表1。6種保護(hù)劑分別以不同的量添加到假單胞菌懸濁液中，混合均勻，預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，菌粉存活率結(jié)果見(jiàn)圖1。與空白組相比，加入保護(hù)劑后，隨著保護(hù)劑濃度的提高，菌體存活率均有不同程度的提升，到達(dá)一定濃度后，過(guò)多保護(hù)劑的加入會(huì)對(duì)菌體存活率產(chǎn)生負(fù)面影響。在最佳濃度條件下，保護(hù)劑對(duì)菌粉保護(hù)效果為：抗壞血酸鈉＞脫脂乳粉＞山梨醇＞甘油＞β-環(huán)糊精＞葡聚糖，上述保護(hù)劑的最優(yōu)添加量分別為：2 wt%、10 wt%、5 wt%、1 wt%、5 wt%和4 wt%，對(duì)應(yīng)的菌粉活菌收率分別為：55%、47%、40%、30%、27%和25%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇保護(hù)效果較好的抗壞血酸鈉、脫脂乳粉、山梨醇及甘油作為假單胞菌凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化研究。

表1 單一保護(hù)劑質(zhì)量濃度

圖1 單一保護(hù)劑對(duì)假單胞菌存活率的影響

2.2 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)假單胞菌存活率的影響

采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳保護(hù)劑配方，正交實(shí)驗(yàn)影響因素及水平見(jiàn)表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表2可知，各因素對(duì)對(duì)假單胞菌凍干后的存活率影響次序?yàn)椋好撝榉郏旧嚼娲迹究箟难崴徕c＞甘油，最優(yōu)保護(hù)劑組合為A2B1C2D2，即脫脂乳粉10%、山梨醇3%、甘油1%和L抗壞血酸鈉2%，此時(shí)活菌菌粉存活率為90%，采用優(yōu)化后的復(fù)合保護(hù)劑配方制備的菌粉活菌存活率，明顯高于單因素保護(hù)劑制備菌粉活菌存活率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用最優(yōu)保護(hù)劑組合為A2B1C2D2作為假單胞菌菌粉凍干保護(hù)劑進(jìn)行研究。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)影響因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 假單胞菌菌粉儲(chǔ)存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

最優(yōu)保護(hù)劑組合為A2B1C2D2作為假單胞菌菌粉凍干保護(hù)劑，實(shí)驗(yàn)選取4℃和25℃兩種溫度條件考察菌粉貯存穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，菌粉活菌數(shù)及存活率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，25℃貯存比4℃貯存菌粉活菌數(shù)下降快，貯存6個(gè)月后，菌粉存活率分別為：50.2%和96.5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凍干菌粉更適合在4℃條件下貯存。

表4 假單胞菌菌粉貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

假單胞菌在真空冷凍干燥過(guò)程中，主要受到冷凍傷害和干燥傷害［16］，前者主要與“胞內(nèi)凍結(jié)”有關(guān)，后者主要與細(xì)胞過(guò)度失水有關(guān)。為提高假單胞菌的凍干存活率，通常采用加入保護(hù)劑的方式，提高細(xì)胞的活性［17］。就保護(hù)劑系統(tǒng)而言，通常加入多種物質(zhì)，協(xié)同強(qiáng)化保護(hù)效果。保護(hù)劑按不同方式可分為滲透型、非滲透型、大分子、小分子等類(lèi)型。滲透型保護(hù)劑可進(jìn)入細(xì)胞，易與水分子結(jié)合，水合作用使溶液的黏性增大，從而弱化了水的結(jié)晶過(guò)程；非滲透型保護(hù)劑不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可在特定溫度降低溶質(zhì)濃度（使溶液呈現(xiàn)過(guò)冷狀態(tài)）；大分子保護(hù)劑通過(guò)“包裹”形式保護(hù)菌體，使細(xì)胞表面免受傷害，單獨(dú)使用效果并不明顯，通常與小分子保護(hù)劑共同使用，可強(qiáng)化小分子保護(hù)劑的保護(hù)作用；小分子保護(hù)劑發(fā)揮主要保護(hù)作用，一些親水且能透過(guò)細(xì)胞膜的小分子，其含有的羥基在凍干過(guò)程中可取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，減緩和抑制冰晶的生長(zhǎng)，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性［13，16，18，19］。

本工作結(jié)合保護(hù)劑作用機(jī)制及前期研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，選擇脫脂乳粉、葡聚糖、甘油、β-環(huán)糊精、山梨醇、抗壞血酸鈉作為凍干保護(hù)劑，篩選得到選擇保護(hù)效果較好的抗壞血酸鈉、脫脂乳粉、山梨醇、甘油進(jìn)行優(yōu)化研究，在最優(yōu)條件下，假單胞菌凍干后的存活率可達(dá)90.3%，說(shuō)明選擇的保護(hù)劑起到較好的保護(hù)效果。但真空冷凍干燥過(guò)程中，干燥工藝條件不僅影響菌的凍干存活率，還影響菌的貯存穩(wěn)定性，整個(gè)干燥過(guò)程中涉及的影響因素較多，如前期菌株生長(zhǎng)條件、預(yù)凍條件、細(xì)胞含水量、保護(hù)劑等。有關(guān)工藝條件與假單胞菌存活率、貯存穩(wěn)定性的關(guān)系，將作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

保護(hù)劑的添加對(duì)提高假單胞菌在冷凍干燥過(guò)程中的存活率有明顯效果，在添加優(yōu)化的復(fù)合保護(hù)劑（脫脂乳粉10%、山梨醇3%、甘油1%和L抗壞血酸鈉2%）條件下，假單胞菌凍干后的存活率可達(dá)90.3%，菌粉在4℃、25℃條件下貯存6個(gè)月的活菌存活率分別為96.5%和50.2%。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Effect of Cryoprotectant on the Survival Rate of Freeze-dried Pseudomonas sp. Powder

LI Li ZHAO Peng-nian ZHU Xi-kun
（Biotechnology and Pharmaceutical Research Laboratory，Shenyang Research Institute of Chemical Industry，Shenyang 110021）

The cryoprotectant presents remarkable effect on increasing the survival rate and stability of freeze-dried Pseudomonas sp. powder. Here single-factor and orthogonal experimental designs were conducted to screen the optimal combination of cryoprotectant. The results showed that the survival rate reached 90% when the concentration of skim milk powder，sorbitol，glycerol，and L-sodium ascorbate were 10%，3%，1%，2%，and was 50.2% while stored for 6 months at 25℃.

Pseudomonas sp.；cryoprotectant；survival rate

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0215

2017-03-21

李麗，女，工程師，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：chemlily@163.com

朱希坤，男，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：zhuxikun@sinochem.com