樊巧英,曹迪迪,張星星,杜宣利,張羽霄,賀軍波,3,胡志雄,3,張維農(nóng),3,齊玉堂

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢430023; 2.西安中糧工程研究設(shè)計院有限公司，西安 710082; 3.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430023)

甘油二酯異構(gòu)體高效液相色譜分析法的建立

樊巧英1,曹迪迪1,張星星1,杜宣利2,張羽霄2,賀軍波1,3,胡志雄1,3,張維農(nóng)1,3,齊玉堂1

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢430023; 2.西安中糧工程研究設(shè)計院有限公司，西安 710082; 3.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430023)

建立了1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯兩種位置異構(gòu)體的高效液相色譜分析方法。最佳色譜分析條件為蒸發(fā)光散射檢測器(漂移管溫度90℃，N2流速2.2 L/min)，流動相為乙腈-異丙醇(體積比95∶5)，流速1.0 mL/min，柱溫35℃；最佳色譜條件下，測得 0.05～5.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.832X+4.564，線性回歸系數(shù)R2=0.998 8，線性關(guān)系良好；該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性，適合結(jié)構(gòu)脂質(zhì)等樣品中甘油二酯位置異構(gòu)體定性、定量分析的要求。

甘油二酯；位置異構(gòu)體；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器；優(yōu)化

甘油二酯(DAG)是一類甘油三酯(TAG)中一個脂肪酸被羥基取代的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，包括1,3-DAG與l,2-DAG兩種異構(gòu)體。近年來，隨著人們對油脂的用途及營養(yǎng)作用越來越關(guān)注，結(jié)構(gòu)脂質(zhì)因其獨特的生理作用現(xiàn)已成為研究熱點，而1,3-DAG作為一種新型的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，因其在體內(nèi)不會蓄積，具有減少內(nèi)臟脂肪、降低血脂、緩解糖尿病、抑制體重等[1-4]特殊的生理功能而備受矚目。因此，高純度1,3-DAG的制備技術(shù)顯得尤為重要。

通常，在DAG的合成過程中會產(chǎn)生1,3-DAG和1,2-DAG兩種同分異構(gòu)體，為此，必須建立一種對于兩種DAG異構(gòu)體的定性定量分析方法。目前，甘油酯的分析方法主要有薄層色譜法(TLC)[5-6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-9]和氣相色譜法(GC)[10-12]等。TLC法操作快速簡單，但精度不高[13]；而GC法需要在高溫條件下程序升溫，造成響應(yīng)值波動大，結(jié)果差別較大。相比而言，HPLC法是一種高效、準(zhǔn)確的甘油酯分析方法[14]。通常該方法采用的檢測器一般有紫外檢測器(UV)、示差折光檢測器(RI)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。甘油酯類物質(zhì)通常在紫外處幾乎沒有響應(yīng)，所以一般較少采用UV定量檢測油脂天然成分；RI和ELSD都是通用型檢測器，適用于無發(fā)色基團(tuán)樣品的分析，對各類物質(zhì)都有響應(yīng)，但是RI檢測器易受環(huán)境溫度和儀器系統(tǒng)的影響，且不能梯度洗脫，精度較差；而ELSD適用于梯度洗脫，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，被廣泛用于甘油酯的分析中[15]。本研究通過優(yōu)化色譜條件，直接分離檢測1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯兩種異構(gòu)體，建立HPLC-ELSD法，為評價1,3-DAG的產(chǎn)品質(zhì)量和指導(dǎo)1,3-DAG的選擇性合成奠定定性和定量分析基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)、1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，瑞典Larodan 公司；1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯樣品，實驗室合成。乙腈、異丙醇均為色譜級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

電子分析天平；SK3300LHC型超聲波清洗器；XW-80A微型旋渦混合儀；Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)；Waters高效液相色譜儀、2489紫外可見光檢測器、2414示差折光檢測器、1525二元泵、2707自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站，美國Waters公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、G1311B四元泵、G1316A柱溫箱、Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器、Open LAB色譜工作站、C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯、1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別將其依次稀釋至0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL系列質(zhì)量濃度。并將0.1 mg/mL 1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液與0.05 mg/mL 1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液混合均勻，作為待分離液，然后運用高效液相色譜進(jìn)行分離檢測。

1.2.2 高效液相色譜法的建立

從檢測器類型、流動相組成、流速、柱溫方面進(jìn)行優(yōu)化，建立1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的高效液相色譜檢測方法，并通過高效液相色譜檢測方法對1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯進(jìn)行定性及定量分析。

1.2.3 1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將上述系列質(zhì)量濃度的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2建立的高效液相色譜法進(jìn)行檢測，記錄相應(yīng)峰面積。以峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)，1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的質(zhì)量濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度實驗

取低、中、高(0.05、0.1、1.0 mg/mL)3種不同質(zhì)量濃度的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種分別采取在同天測定5次及連續(xù)5 d的測定方式進(jìn)行高效液相色譜檢測。根據(jù)測得峰面積得出實際樣品質(zhì)量濃度，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，用來評價方法的精密度。

1.2.5 加標(biāo)回收率實驗

取0.9 mL質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1 mg/mL的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯樣品，向其中分別添加0.1 mL質(zhì)量濃度依次為0(空白對照)、0.05、0.1 mg/mL的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻。按照優(yōu)化后的高效液相色譜法進(jìn)行檢測，根據(jù)目標(biāo)峰的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算實際樣品質(zhì)量濃度，并計算樣品加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測器的選擇

通常，高效液相色譜法采用的檢測器一般有紫外檢測器(UV)、示差折光檢測器(RI)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)3種，為了確保所建立高效液相色譜法具有較高的靈敏度，結(jié)合現(xiàn)有實驗條件，對上述3種檢測器作了對比分析，實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，UV作檢測器時，甘油二酯的響應(yīng)值較小，RI作檢測器時，峰形對稱性較差，出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，兩者均不利于后續(xù)分析；ELSD作檢測器時，峰形對稱性好，柱效及靈敏度較高。因此，選取ELSD作為后續(xù)分析時的檢測器。

注：1. 1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯； 2. 1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯。下同。

圖1不同檢測器條件下1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯、1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯的HPLC圖譜

2.2 色譜分析條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

在反相色譜分離體系中，流動相的組成一般為水、甲醇、乙腈或者極性有機(jī)溶劑的混合液等，由于DAG分子碳鏈較長，疏水性較強(qiáng)，綜合考慮分析效率與分析成本，選擇乙腈、異丙醇等常見強(qiáng)洗脫性能的溶劑較佳。本實驗控制其他條件不變，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，ELSD漂移管溫度90℃，N2流速2.2 L/min，選取一定比例的乙腈-異丙醇混合液作為流動相，通過調(diào)節(jié)異丙醇的比例，考察不同流動相組成對兩種異構(gòu)體的分離效果，結(jié)果如圖2、表 1所示。從圖2、表1可以看出，流動相中異丙醇的含量對樣品保留時間影響較大，隨著流動相中異丙醇含量的升高，樣品保留時間不斷縮短，其中100%乙腈作流動相時，1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯、1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯的保留時間分別為32.43、35.49 min，而體積比70∶30的乙腈-異丙醇作流動相時，其對應(yīng)的保留時間僅為8.59、8.96 min；另外，隨著流動相中異丙醇含量的升高，樣品分離度和容量因子均隨之不斷減小，100%乙腈作流動相時，分離度可達(dá)2.30；而體積比70∶30的乙腈-異丙醇作流動相時，分離度僅為0.85。因此， 從分析效率和分離度等因素綜合考慮，選取體積比為95∶5的乙腈-異丙醇作流動相最為合適。

乙腈-異丙醇體積比保留時間/min1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯容量因子k分離度Rs100%乙腈32．4335．4922．572．3095∶526．3128．4115．542．2590∶1020．2821．809．261．6885∶1515．9617．037．311．1580∶2012．8413．625．861．0170∶308．598．961．830．85

2.2.2 流速的選擇

流速是影響色譜柱效與分析效率的重要條件，因此有必要對流速進(jìn)行優(yōu)化。本實驗在固定其他條件不變的情況下，分別選取流速為0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min進(jìn)行檢測，比較不同流速條件下的分離效果。結(jié)果表明：隨著流速增大，目標(biāo)峰的保留時間逐漸減小，樣品分析時間縮短，在流速為0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min條件下，對應(yīng)的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯和1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯的保留時間分別為30.6、27.0、24.1、21.8、19.9 min和33.0、29.1、26.1、23.6、21.5 min；其峰形逐漸變窄，且兩目標(biāo)峰間距逐漸縮小，但對分離度影響不大，以上流速條件下分離度均大于1.5，能達(dá)到基線分離的效果。綜合考慮樣品分析時間、流動相消耗、柱效等因素，選擇最佳流速為1.0 mL/min。

2.2.3 柱溫的選擇

在色譜分離中，柱溫對分離選擇因子α和容量因子k有影響，為了獲取最佳的α值與k值，控制柱溫在30、35、40、45℃ 4個水平，考察柱溫對分離效果的影響。結(jié)果表明，在不同柱溫條件下，對兩種異構(gòu)體的分離度的影響不大，但隨著柱溫的升高，目標(biāo)峰的保留時間逐漸減小，樣品分析時間縮短。考慮到柱溫對色譜柱壽命的影響，選取的最佳柱溫為35℃。

2.3 1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.2.1所配制的0.05～5.0 mg/mL 系列質(zhì)量濃度的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶

液按照1.2.2所建立的優(yōu)化條件分別進(jìn)行色譜分析，記錄相應(yīng)色譜峰面積，以1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的質(zhì)量濃度(C)的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積(A)的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。由圖3可以看出，線性回歸方程為Y=1.832X+4.564(R2=0.998 8)，表明在0.05～5.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，靈敏度高，完全滿足定量分析要求。

圖3 1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度實驗

為考察方法的精密度，實驗選取低、中、高(0.05、0.1、1.0 mg/mL)3種不同質(zhì)量濃度的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.4方法進(jìn)行高效液相色譜檢測，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，同天重復(fù)測樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.51%～3.48%范圍內(nèi)，回收率在94.61%～101.52%范圍內(nèi)；連續(xù)5 d 測樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.65%～3.67%范圍內(nèi)，回收率在96.32%～102.50%范圍內(nèi)。表明該方法具有良好的重現(xiàn)性、精密度、準(zhǔn)確度。

表2 精密度實驗結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收率實驗

取不同質(zhì)量濃度(0.05、0.1 mg/mL)的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯樣品0.9 mL，按照1.2.5方法分別添加一定量的1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后，按照優(yōu)化后的高效液相色譜方法進(jìn)行檢測，根據(jù)目標(biāo)峰的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出實際樣品質(zhì)量濃度，并計算出樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

由表3可以看出，所有樣品的加標(biāo)回收率均在98.00%～102.22%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.18%～4.25%范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性，符合測定要求。

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯與1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯分離檢測的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)方法，并優(yōu)化了檢測條件。最佳檢測條件為：ELSD為檢測器，ELSD漂移管溫度90℃，N2流速2.2 L/min；流動相為體積比95∶5的乙腈-異丙醇；流速1.0 mL/min；柱溫35℃。在此條件下1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的保留時間為26.31 min，1-月桂酸-2-棕櫚酸甘油二酯保留時間為28.41 min。依據(jù)優(yōu)化后的色譜條件，繪制1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得在0.05～5.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，1-月桂酸-3-棕櫚酸甘油二酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.832X+4.564，線性回歸系數(shù)R2=0.998 8，線性關(guān)系良好。該方法重現(xiàn)性好，具有良好的精密度和靈敏度，適用于1,3-DAG的定量及定性分析。

[1] 喬曉萍, 蔡東聯(lián). 甘油二酯與代謝性疾病[J]. 食品科技, 2007, 32(1): 224-227.

[2] 鄒冬芽, 孟祥河, 段作營, 等. 1,3-甘油二酯減肥降血脂功能的研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2004, 26(5): 333-336.

[3] NAGAO T, WATANABE H, GOTO N, et al. Dietary diacylglycerol suppresses accumulation of body fat compared to triacylglycerol in men in a double-blind controlled trial[J]. J Nutr, 2000, 130(4): 792-797.

[4] SAITO S, TOMONOBU K, HASE T, et al. Effects of diacylglycerol on postprandial energy expenditure and respiratory quotient in healthy subjects[J].Nutrition, 2006, 22(1): 30-35.

[5] FUCHS B, Süβ R, TEUBER K, et al. Lipid analysis by

thin-layer chromatography—a review of the current state[J]. J Chromatogr A, 2010, 1218(19): 2754-2774.

[6] 周思, 王志耕, 梅林, 等. 乳脂中1,3-甘油二酯檢測方法的研究[J]. 中國油脂, 2011,36(7): 67-70.

[7] FEDOSOV S N, FERNANDES N A, FIRDAUS M Y, et al. Analysis of oil-biodiesel samples by high performance liquid chromatography using the normal phase column of new generation and the evaporative light scattering detector[J]. J Chromatogr A, 2014, 1326(1): 56-62.

[8] 鐘南京, 李琳, 李冰, 等. 甘油酯的液相色譜分析[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(1): 123-126.

[9] 汪勇,宋坷珂, 王麗麗, 等. 反相高效液相色譜法測定甘油二酯含量研究[J]. 中國糧油學(xué)報, 2010, 25(3): 119-123.

[10] 李長秀, 唐忠, 楊海鷹. 氣相色譜法測定生物柴油樣品中脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油酯的含量[J]. 分析測試學(xué)報, 2005, 24(5): 66-68.

[11] LIPP M.Determination of the adulteration of butter fat by its triglyceride composition obtained by GC. A comparison of the suitability of PLS and neural networks[J]. Food Chem, 1996, 55(4): 389-395.

[12] 王志遠(yuǎn), 李曉, 周超群, 等. 蘋果籽油脂肪酸及甘油三酯組成分析[J]. 糧食與油脂, 2015, 28(1):36-38.

[13] 孟祥河, 章銀軍, 毛忠貴. 甘油酯的分析方法[J]. 中國油脂, 2004, 29(1): 44-46.

[14] CARELLI A A, CERT A. Comparative study of the determination of triacylglycerol in vegetable oils using chromatographic techniques[J]. J Chromatogr A, 1993, 630(1/2):213-222.

[15] HOPIA A I, OLLILAINEN V M. Comparison of the evaporative light scattering detector (ELSD) and refractive index detector (RID) in lipid analysis[J]. J Liquid Chromatogr Related Technol, 1993, 16(12):2469-2482.

·廣告·

Determinationofdiacylglycerolpositionalisomersbyhighperformanceliquidchromatography

FAN Qiaoying1, CAO Didi1, ZHANG Xingxing1, DU Xuanli2, ZHANG Yuxiao2, HE Junbo1,3, HU Zhixiong1,3, ZHANG Weinong1,3, QI Yutang1

(1.College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2.Xi’an COFCO Engineering Research & Design Institute Co., Ltd., Xi’an 710082, China; 3.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

A HPLC method was developed for the separation of 1-laurin-3-palmitin diacylglycerol and 1-laurin-2-palmitin diacylglycerol. The optimal chromatographic analysis conditions were obtained as follows: evaporative light scattering detection (ELSD) as detector (drift tube temperature 90℃ and N2flow rate 2.2 L/min), mobile phase of acetonitrile-isopropanol (volume ratio 95∶5), flow rate 1.0 mL/min, column temperature 35℃. Under the optimal chromatographic analysis conditions, the standard curve equation of 1-laurin-3-palmitin diacylglycerol (mass concentration range 0.05-5.00mg/mL) wasY= 1.832X+ 4.564 with a good linear regression coefficient (R2=0.998 8). The method showed good reproducibility, precision and accuracy, which was beneficial for the qualitative and quantitative analysis of diacylglycerol positional isomers in structural lipids.

diacylglycerol; positional isomers; high performance liquid chromatography- evaporative light scattering detector; optimization

2016-11-10；

：2017-04-20

國家自然科學(xué)基金項目(31371783)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2014BAD04B03)；國家糧食局公益性行業(yè)科研專項(201313007，201513003)

樊巧英(1990)，女，在讀碩士，研究方向為油脂質(zhì)量檢測與安全控制(E-mail) fanqiaoying2015@163.com。

胡志雄，副教授(E-mail) e_huzhixiong@126.com；張維農(nóng)，教授(E-mail) zhangweinong@163.com。

TQ646.2;TS225.6

：A

1003-7969(2017)08-0131-05

檢測分析