秦 峰 曾德龍 高成偉 秦新民

(廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林，541004)

無(wú)蹼壁虎線粒體全基因組及系統(tǒng)發(fā)育分析

秦 峰 曾德龍 高成偉 秦新民*

(廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林，541004)

稿件運(yùn)行過(guò)程

無(wú)墣壁虎； 線粒體基因組； 系統(tǒng)發(fā)育

無(wú)蹼壁虎(Gekkoswinhonis)屬壁虎科(Gekkonidae)壁虎屬動(dòng)物，主要分布于遼寧、河北、陜西、河南、山東、江蘇、安徽、浙江、廣西等地，常見(jiàn)于暖溫帶以及棲息在建筑物的縫隙、巖縫、石下及樹(shù)上。無(wú)蹼壁虎為我國(guó)的特有物種，該物種已被列入中國(guó)國(guó)家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》。人們對(duì)無(wú)蹼壁虎的形態(tài)、生態(tài)、行為，以及藥用價(jià)值等方面進(jìn)行過(guò)研究[1-6]，但其線粒體基因組和系統(tǒng)發(fā)育的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)無(wú)蹼壁虎的線粒體基因組進(jìn)行了測(cè)序和基因組結(jié)構(gòu)特征分析，并對(duì)無(wú)蹼壁虎的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)蹼壁虎，采集于廣西壯族自治區(qū)防城港。取其尾部肌肉為實(shí)驗(yàn)材料 。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取

DNA提取方法參照汪永慶等[7]報(bào)道的SDS/蛋白酶K裂解法進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)、PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定

本研究中部分PCR引物參考已公布的線粒體基因組擴(kuò)增通用引物[8]，其余通過(guò)從Genbank下載壁虎科、蜥蜴科(Lacertidae)的線粒體基因組全序列或部分序列用軟件Clustal X 1.83比對(duì)，以找到合適保守位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出含簡(jiǎn)并位點(diǎn)的引物。部分引物無(wú)法擴(kuò)增出產(chǎn)物，待其他片斷序列完成后用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，使所設(shè)計(jì)的引物能夠擴(kuò)增出覆蓋無(wú)蹼壁虎的線粒體全基因組序列(表1)。

表1 擴(kuò)增無(wú)蹼壁虎線粒體基因組全序列所用的引物

Tab.1 List of primers used to amplify and sequence the mitogenome of Gekko swinhonis

注：簡(jiǎn)并引物中所用的字符：R(A，g)，Y(C，T)，M(A，C)，K(g，T)，S(g，C)，W(A，T)，H(A，T，C)，B(g，T，C)，D(g，A，T)，N(A，T，g，C)

Note：Characters of degenerate primer are as follow：R(A，g)，Y(C，T)，M(A，C)，K(g，T)，S(g，C)，W(A，T)，H(A，T，C)，B(g，T，C)，D(g，A，T)，N(A，T，g，C)

本實(shí)驗(yàn)PCR的反應(yīng)體系為50 μl，包括：25 μl 2×TaqPCR Master Mix(TIANGEN)，上、下游引物各0.5 μl，模板總DNA 1.0 μl，ddH2O 23 μl。

PCR的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；退火30 s，溫度因引物而異，約比引物Tm值低2～5℃；72℃延伸，時(shí)間因各所擴(kuò)片斷而異，按1min/kb設(shè)置；循環(huán)次數(shù)為35次；循環(huán)結(jié)束后72℃保溫10 min。

非簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增且無(wú)雜帶的PCR產(chǎn)物直接委托華大基因進(jìn)行雙向測(cè)序，少數(shù)含非特異性條帶的PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后再測(cè)序。簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的PCR片段經(jīng)純化后與TaKaRa pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后再用載體的通用引物測(cè)序。

1.2.3 序列拼接及注釋

經(jīng)測(cè)序得到的DNA片斷用DNAStar(DNASTAR，Inc.)軟件包的SeqMan進(jìn)行組裝拼接。各蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因通過(guò)與GenBank中近緣物種的線粒體基因進(jìn)行同源比對(duì)定位。tRNA基因的查找、定位及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用在線版的tRNAscan-SE Search Server[9]。用MEGA 4.1[10]軟件對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行翻譯，最后用Sequin 11.0對(duì)全序列進(jìn)行注釋，并提交至GenBank(登錄號(hào)：JQ906550)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將35個(gè)物種(包括外群)線粒體全基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列進(jìn)行構(gòu)樹(shù)。構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)前，利用Clustal X 1.83的默認(rèn)設(shè)置，將核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。然后，經(jīng)過(guò)軟件Modeltest 3.7檢測(cè)，得出用于BI法分析的最適的核苷酸和氨基酸的替代模型為GTR+I+G。最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 全基因組的序列結(jié)構(gòu)和堿基組成

2.1.1 基因組結(jié)構(gòu)特征

無(wú)蹼壁虎的mtDNA為閉合環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)16 818 bp，經(jīng)注釋的序列已提交至GenBank(登錄號(hào)為JQ906550)。無(wú)蹼壁虎線粒體基因組共有37個(gè)基因(圖1，表2)，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、1個(gè)主要的非編碼區(qū)(D-loop)、2個(gè)核糖體rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)。其中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因包括細(xì)胞色素b基因、腺苷三磷酸酶亞基(ATP6，ATP8)、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ-Ⅲ基因(CO1-CO3)和7個(gè)NADH氧化還原酶亞基(ND1-DN6，ND4L)。

圖1 無(wú)蹼壁虎線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of structure of Gekko swinhonis mitogenome

2.1.2 堿基組成特征

無(wú)蹼壁虎線粒體基因組不同區(qū)域和蛋白質(zhì)編碼基因密碼子各位置的堿基組成見(jiàn)表3。全基因組的A+T(57.63%)含量高于G+C(42.37%)，呈現(xiàn)GC偏斜，GC偏斜為-0.308，AT偏斜值為0.088。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因平均AT含量為57.65%。密碼子第一到第三位的AT含量分別為：52.25%，58.44%和62.27%。從表3可以看出，密碼子不同位置的AT偏向性的程度也不同，AT含量最低的是第一位，最高的是第三位，這主要是因?yàn)槊艽a子第三位置上的堿基受到的功能選擇壓較小，可以自由突變，所以受不同鏈的AT偏好影響較大。

2.1.3 蛋白質(zhì)編碼基因

無(wú)蹼壁虎線粒體的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，12個(gè)基因都使用ATG為起始密碼子，只有ND2基因以ATA為起始密碼子。無(wú)蹼壁虎5個(gè)基因(ND1、ATP8、ATP6、ND4L、ND4)以TAA為終止密碼子，ND6和Cytb兩個(gè)基因以TAG為終止密碼子，CO1以AGA為終止密碼，其余5個(gè)基因?yàn)椴煌耆K止密碼TA-或T-(ND2、CO2、ND5和CO3為T(mén)-，ND3為T(mén)A-)。

利用MEGA 5.1軟件對(duì)無(wú)蹼壁虎線粒體基因組去除終止密碼后的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的相對(duì)同義密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage，RSCU)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表4)。無(wú)蹼壁虎使用最多的氨基酸均為亮氨酸(L)，使用頻率為659，而且亮氨基的密碼子恰是20種氨基酸中最多的一個(gè)，一共有6個(gè)同義密碼子。單個(gè)密碼子的使用情況，CUA(231次)，AUU頻率為150。由于密碼子第三位置強(qiáng)烈AT偏向性的影響，同一個(gè)氨基酸的幾個(gè)同義密碼子中，NNU和NNA密碼子RSCU基本都大于1。

表2 無(wú)蹼壁虎線粒體基因組結(jié)構(gòu)和特征

Tab.2 Organization and features of Gekko swinhonis mitochonrial genome

表3 無(wú)蹼壁虎線粒體基因組不同區(qū)域的堿基組成

Tab.3 Nucleotide composition of the mitochondrial genome of Gekko swinhonis

表4 無(wú)蹼壁虎線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用頻率及相對(duì)同義密碼子使用情況

Tab.4 Codon frequency and relteive synonymous codon usage(RSCU)of Gekko swinhonis mitogenome protein-coding genes

注：終止密碼子未統(tǒng)計(jì)

Note：Termination codons are excluded

2.1.4 核糖體RNA基因及轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因

無(wú)蹼壁虎2個(gè)核糖體RNA基因位于tRNAPhe和tRNALeu(UUR)基因之間，中間由tRNAVal基因隔開(kāi)。12S rRNA基因全長(zhǎng)951 bp，各堿基含量分別為：33.23%(A)、20.40%(T)、28.29%(C)、18.09%(G)，AT含量為53.63%；16S rRNA基因全長(zhǎng)1 568 bp，各堿基含量分別為：33.99%(A)、20.41%(T)、27.23%(C)、18.37%(G)，AT含量為54.40%。22個(gè)tRNA基因的總長(zhǎng)度為1 514 bp，各堿基含量分別為：31.11%(A)、27.68%(T)、23.84%(C)、17.37%(G)，AT含量58.78%，其中最長(zhǎng)的tRNA為tRNALeu(UUR)和tRNASer(UCN)，長(zhǎng)度均為75 bp，最短的為tRNASer(GCU)，62 bp，其二級(jí)結(jié)構(gòu)缺失了DHU臂而未形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 無(wú)蹼壁虎tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 Predicted secondary structure of tRNAs in Gekko swinhonis

2.1.5 控制區(qū)

無(wú)蹼壁虎線粒體控制區(qū)(D-loop)位于tRNAPro和tRNAPhe之間，長(zhǎng)度為1 456 bp，占整個(gè)基因組的8.66%，其堿基組成為：31.99% A、27.96% C、13.57% G、26.48% T。在控制區(qū)的5′端存在一個(gè)重復(fù)6次的串聯(lián)重復(fù)序列(5′-TGAATATTATATAGTACATTATATTAATGATATGGGATATACTA GTATATAGTA CATACATTTACTTACCCCA-3′)，其中包含有1個(gè)終止序列(TAS)(5′-ACATTATATTAAT-3′)。此外，在控制區(qū)的3′端有3個(gè)CBS序列：分別為CSB-1(5′-ATTTCATTCATGCTCGATGGGCATA-3′)，CSB-2：(5′-CAAACCCCCCTTACCCC-3′)和 CBS-3(5′-CGCCAAACCCCTAAAACG-3′)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探討無(wú)蹼壁虎的系統(tǒng)發(fā)育地位，本研究從GenBank中下載了33個(gè)有鱗目(Squamata)物種(包括本研究的無(wú)蹼壁虎)，以鱷目(Crocodylia)的Caimancrocodylus和鳥(niǎo)綱的Buteobuteo2個(gè)物種作為外群。以35個(gè)物種(包括2個(gè)外群)線粒體基因組中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列為數(shù)據(jù)集進(jìn)行BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，各物種的種名及GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表5。

表5 本研究用于系統(tǒng)發(fā)育分析物種的相關(guān)信息

Tab.5 List of the complete mitogenome in the phylogenetic analyses

續(xù)表5

所構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)的支持率很高，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的后驗(yàn)概率(posterior probability)均為1.00(圖3)。系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)將有鱗目分為兩大支，一支蛇亞目(Serpentes)與端生齒類(lèi)(Acrodonta)組成的姐妹支，另一支包括了由石龍子科(Scincidae)和雙足蜥科(Dibamidae)組成的小支再與美洲鬣蜥科(Iguanidae)相聚形成的姐妹支，蚓蜥亞目(Amphisbaenia)與蜥蜴科組成的姐妹支，以及夜蜥科(Xantusiidae)、環(huán)尾蜥科(Cordylidae)和壁虎科物種。

3 討論

本研究選用了鱷目的Caimancrocodylus和鳥(niǎo)綱Buteobuteo兩個(gè)物種作為外群，與內(nèi)群33個(gè)物種BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

3.1 有鱗目的基部類(lèi)群

Camp[11]基于形態(tài)特征將有鱗目劃分為鬣蜥亞目(Lguania)和硬舌亞目(Scleroglossa)。然而基于分子系統(tǒng)學(xué)的研究卻與形態(tài)學(xué)上的劃分方法不大一致，Vidal和Hedges[12]基于核基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中雙足蜥科位于有鱗目的基部位置，Zhou等[13]基于線粒體全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中將有鱗目劃分為蛇亞目和蜥蜴亞目?jī)纱笾В珹lbert等[14]同樣基于線粒體基因組全序列的研究又得出來(lái)另一個(gè)結(jié)果：蛇與端生齒類(lèi)組成的姐妹群是有鱗目群。因此，在基于分子標(biāo)記的有鱗目系統(tǒng)發(fā)育研究中，有鱗目的基部類(lèi)群尚存在較大的分歧。在本研究的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，蛇亞目與端生齒類(lèi)組成的姐妹支，結(jié)果與Albert等[14]觀點(diǎn)相同，而不支持形態(tài)學(xué)上將有鱗目劃分為鬣蜥亞目和硬舌亞目的觀點(diǎn)。

圖3 基于 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 BI trees based on the concatenated amino acid sequences of the 13 PCGs

3.2 亞目分類(lèi)單元的單系性

科級(jí)以上的分類(lèi)群中，蚓蜥亞目、蛇亞目、端生齒類(lèi)和蛇蚓下目(Anguimorpha)4個(gè)類(lèi)群的單系性得到大部分系統(tǒng)樹(shù)的支持。其中，蛇亞目和端生齒類(lèi)兩個(gè)類(lèi)群的單系性BI系統(tǒng)樹(shù)中得到1.00的貝葉斯后驗(yàn)概率支持。但石龍子下目(Scincomorpha)的單系性在本研究中未得到支持。

3.3 科級(jí)分類(lèi)單元的單系性

所選的物種范圍內(nèi)幾乎所有科級(jí)分類(lèi)單元的單系性在所有系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中都得到支持。僅有蚓蜥科在所有的樹(shù)中都因短頭蚓蜥科(Trogonophidae)的嵌入而成為并系群，而且涉及到的4個(gè)物種的關(guān)系在所有的樹(shù)中也始終保存恒定，為(Blanuscinereus，(Diplometoponzarudnyi，(Amphisbaenaschmidti，Geocalamusacutus)))。

3.4 無(wú)蹼壁虎的系統(tǒng)發(fā)育

壁虎科在本研究的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中呈現(xiàn)出單系性。無(wú)蹼壁虎屬壁虎科動(dòng)物，在BI系統(tǒng)樹(shù)中無(wú)蹼壁虎先與Tarentolamauritanica相聚，然后再與Coleonyxvariegatus聚為一支，與形態(tài)分類(lèi)學(xué)的觀點(diǎn)相符。

近年來(lái)，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多物種的線粒體基因組全序列被測(cè)定，不少研究者開(kāi)始利用線粒體基因組全序列的信息對(duì)有鱗目高階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行探討。Kumazawa(2004)[15]測(cè)定了4種蜥蜴和1種蛇類(lèi)的線粒體基因組全序列，并從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了另4條有鱗目序列及其他外群，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持蛇與蜥蜴的單系性。Zhou等(2006)[13]利用15個(gè)有鱗目物種代表了13個(gè)科的線粒體基因組全序列，重構(gòu)了有鱗目系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果與Kumazawa[15]相似，同樣支持將有鱗目分為蛇亞目與蜥蜴亞目(Sauria)兩個(gè)姐妹支。它們結(jié)果還支持壁虎下目與蚓蜥的姐妹群關(guān)系，這一觀點(diǎn)與大部分形態(tài)學(xué)及分子數(shù)據(jù)的結(jié)論不一致。2006年，Douglas等[16]新測(cè)定了5種蛇的線粒體基因組全序列，但得出了與Zhou等[13]不一致的結(jié)果，認(rèn)為與蛇關(guān)系最近的是蚓蜥，并不支持有鱗目分為蛇亞目與蜥蜴亞目的觀點(diǎn)。隨后，Kumazawa(2007)[17]又新測(cè)定了來(lái)自7個(gè)不同科的有鱗目物種線粒體基因的序列，再次探討了有鱗目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果依舊未能確定蛇類(lèi)的位置，另顯示石龍子下目(Scincomorpha)為并系群，壁虎下目(Gekkota)位于有鱗目基部。

目前，基于形態(tài)和分子數(shù)據(jù)得到的有鱗目系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚沒(méi)有較一致的結(jié)論，真正弄清有鱗目?jī)?nèi)部的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍有待今后深入研究。

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Gekkoswinhonis； Mitochondrial genome； Phylogeny

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得了無(wú)蹼壁虎(Gekkoswinhonis)的線粒體基因組全序列，其總長(zhǎng)為16 818 bp，含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和1個(gè)控制區(qū)。各基因的位置、排列順序及轉(zhuǎn)錄方向均和大部分的有鱗目物種一致。無(wú)蹼壁虎線粒體基因組的堿基組成分別為：A(31.35%)、T(26.28%)、C(27.71%)、G(14.67%)。除Ser(GCU)缺失DHU臂外，其余的21個(gè)tRNA都可以形成典型三葉草結(jié)構(gòu)。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，除ND2基因以ATA為起始密碼子外，其余12個(gè)基因均使用ATG為起始密碼子。無(wú)蹼壁虎5個(gè)基因(ND1、ATP8、ATP6、ND4L、ND4)以TAA為終止密碼子，ND6和Cytb基因以TAG為終止密碼子，CO1以AGA為終止密碼，其余5個(gè)基因?yàn)椴煌耆K止密碼TA-或T-(ND2、CO2、ND5和CO3為T(mén)-，ND3為T(mén)A-)?？刂茀^(qū)位于tRNAPro和 tRNAPhe之間，全長(zhǎng)1 456 bp，含有一些終止相關(guān)序列和保守序列(TAS，CBS1-3)?；?3個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因氨基酸序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，無(wú)蹼壁虎與壁虎科的Tarentolamauritanica的親緣關(guān)系最近。

Complete Mitochondrial Genome of Peking Gecko(Gekkoswinhonis)and Phylogenetic Analysis

Qin Feng Zeng Delong Gao Chengwei Qin Xinmin*

(College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin，541004，China)

The complete nucleotide sequence of the mitochondrial genome of Peking gecko(Gekkoswinhonis)was determined by using PCR amplification and DNA sequencing.The results indicated a circular molecule of 16 818 bp，including 13 protein-coding genes，2 rRNA genes，22 tRNA genes，as well as a control region(D-loop).The gene arrangement pattern，order，and transcribing directions proved like those of other Squamata species.The nucleotide compositions of A，T，C，G were 1.35%，26.28%，27.71% and 14.67%，respectively．The secondary structures of tRNAs were predicted by tRNAscan-SE online server，all the tRNAs could form the typical cloverleaf structure except for tRNASer(AGY)，whose T-arm was lacking.Excepting the initiation codons of the ND2 gene that were a CGA codon，the other protein coding genes started with an ATA codon.Within the stop codons of 13 protein-coding genes，five genes(ND1，ATP8，ATP6，ND4L and ND4)ended with TAA stop codon.Two genes(ND6 and Cytb)ended with TAG or COI with AGA.The remaining five genes(ND3 with TA-，ND2，ND5，COII and COIII with T-)had incomplete stop codons.The control region was located between the tRNAProand tRNAPhegenes，and was 1 456 bp in length.Some tandem repeat sequences and conserved elements(TAS，CSB1-3)were found in the control region.The Bayesian inference(BI)phylogenetic analyses based on the 13 PCG amino acid sequences showed that that Peking gecko is closely related toTarentolamauritanicawithin Gekkonidae.

廣西珍稀瀕危動(dòng)物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(1501z003)

秦峰，男，31歲，講師；主要從事動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究。

*通訊作者：秦新民，E-mail：xmqin@mailbox.gxnu.edu.cn

2016-07-03

Q951+.3 Q78

A

修回日期：2016-08-12

發(fā)表日期：2017-02-10

2310-1490(2017)01-094-09