,, , ,,同存,,*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457; 2.天津科技大學(xué)造紙學(xué)院,天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457;3.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國林業(yè)科學(xué)院,北京100091)

元寶楓油的超聲提取及其萌發(fā)前后神經(jīng)酸含量分析

閆莉華1,陳冬菊1,李潛1,張川1,司傳領(lǐng)2,3,張同存1,羅學(xué)剛1,*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457; 2.天津科技大學(xué)造紙學(xué)院,天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457;3.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國林業(yè)科學(xué)院,北京100091)

以元寶楓種仁為研究對象,油脂得率為評價(jià)指標(biāo),通過超聲功率、超聲時(shí)間、料液比單因素實(shí)驗(yàn),建立元寶楓油超聲提取方法。同時(shí)優(yōu)化元寶楓種子萌發(fā)溫度,利用氣相色譜法分析了萌發(fā)前后種仁油中神經(jīng)酸含量的變化,并通過MTT法分析了萌發(fā)前后元寶楓種仁油對神經(jīng)細(xì)胞的影響。結(jié)果表明:通過單因素確定的最佳提取工藝條件為:超聲功率200 W、超聲溫度25 ℃、料液比1∶12。元寶楓種子人工萌發(fā)的最佳溫度是4 ℃,氣相色譜分析顯示萌發(fā)后元寶楓種仁油中神經(jīng)酸含量顯著上升,可達(dá)萌發(fā)前的1.5倍。結(jié)果顯示元寶楓種仁油能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖,且萌發(fā)后的種仁油作用更強(qiáng)。

元寶楓,超聲輔助提取,神經(jīng)酸,萌發(fā),增殖

元寶楓(AcertruncatumBunge)又稱元寶槭、華北五角槭、色樹、五角樹、楓香樹,為槭樹科(Aceraceae)的落葉喬木,被稱為“生命之樹”[1-2]。元寶楓是只存在于我國的植物,因翅果像我國古代的元寶而得名[3-4]。作為一種優(yōu)質(zhì)的木本油料,種仁含油量約達(dá)50%,其中約含6.0%的神經(jīng)酸使其價(jià)值遠(yuǎn)高于其它油料,因此元寶楓油已于2011年被我國衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員批準(zhǔn)為新資源食品[5-6]。

神經(jīng)酸是目前已發(fā)現(xiàn)的唯一能促進(jìn)受損神經(jīng)組織修復(fù)和再生的天然活性物質(zhì),是大腦神經(jīng)纖維和神經(jīng)細(xì)胞的核心天然成分,在腦組織和神經(jīng)組織中含量很高,是發(fā)育大腦所需的必需營養(yǎng)元素,對提高腦神經(jīng)的活躍程度有很大作用[7-9]。但是神經(jīng)酸最早發(fā)現(xiàn)于鯊魚的神經(jīng)組織中,由于鯊魚數(shù)量稀少,并且大規(guī)模捕殺鯊魚會破壞生態(tài)系統(tǒng),導(dǎo)致神經(jīng)酸的獲取受到限制[10-12]。目前神經(jīng)酸的生產(chǎn)方法主要有天然提取法、有機(jī)化學(xué)合成法及生物催化合成法等。其中,有機(jī)化學(xué)合成法主要是將芥酸甲酯等通過化學(xué)合成的方法得到神經(jīng)酸,這類方法合成得率較低,副產(chǎn)物較多[13];生物催化合成法則以酶為催化劑或直接采用微生物發(fā)酵的方式,以芥酸等作為底物進(jìn)行生物催化合成,這類方法因工藝路線較長、得率低而缺乏實(shí)用性[14-15]。隨著油脂化學(xué)的發(fā)展,科學(xué)家們檢測出某些植物的果實(shí)和種子油中富含神經(jīng)酸,這一發(fā)現(xiàn)使得以植物等非保護(hù)性生物資源為原料的天然提取法更加為人們所重視[16-19]。

本研究以富含神經(jīng)酸的元寶楓種子為研究材料,探索其種仁油提取率及種子萌發(fā)的最適條件,通過超聲提取、氣相分析等方法,探討元寶楓種子萌發(fā)過程中神經(jīng)酸含量變化及其對神經(jīng)細(xì)胞的作用,以期為生產(chǎn)相關(guān)藥物、保健品的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

元寶楓種子 陜西省楊凌金道種子公司;石油醚(沸程60～90 ℃) 江天化工;大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)庫保藏委員會細(xì)胞庫;D-MEM/低糖培養(yǎng)基 Life Technologies Gibco公司;Nervonic acid -analytical standard SIGMA-ALDRICH中國分公司;MTT 索萊寶生物技術(shù)公司;正己烷、二甲基亞砜(DMSO) 為國產(chǎn)分析純。

JJ200型精密電子天平 上海精天儀器有限公司;7890A氣相色譜儀 Agilent公司;HF-10B超聲提取器 弘龍祥生物技術(shù)有限公司;R-3 HB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCHI公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 元寶楓種仁油超聲提取法的建立

1.2.1.1 工藝流程 準(zhǔn)確稱取經(jīng)高速粉碎機(jī)充分研磨的元寶楓種仁粉5.0 g,粉顆粒度約為1.0 mm,放入帶蓋的容器中,用石油醚(沸程60～90 ℃)為提取劑,進(jìn)行超聲波輔助提取,提取結(jié)束后用減壓抽濾法將提取液與殘?jiān)蛛x,收集所得濾液置于-0.08 MPa,轉(zhuǎn)速為120 r/min的真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā),并在35 ℃水浴中將溶劑揮發(fā)后得油脂,再置于干燥器中至恒重,稱取提取油脂的重量,計(jì)算油脂得率。

1.2.1.2 超聲提取參數(shù)的確定 本實(shí)驗(yàn)選擇超聲功率、超聲溫度、料液比為研究因素。a.超聲功率的確定:在提取溶劑為石油醚溶液,料液比 1∶12 (m∶v),超聲溫度25 ℃,超聲時(shí)間40 min的條件下,考察超聲功率50、200、350、500 W對元寶楓種仁粉殘留油脂提取的影響;b.超聲溫度的確定:在提取溶劑為石油醚溶液,料液比1∶12 (m∶v),超聲功率200 W,超聲時(shí)間40 min的條件下,考察超聲溫度15、25、35、45、55 ℃對元寶楓種仁粉殘留油脂提取的影響;c.料液比的確定:在提取溶劑為石油醚溶液,超聲功率200 W,超聲溫度25 ℃,超聲時(shí)間40 min條件下,考察料液比(m∶v)1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20對元寶楓種仁粉殘留油脂提取的影響,其他程序如上。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算油脂得率,取平均值。

1.2.1.3 油脂得率的計(jì)算

油脂得率(%)=提取油脂質(zhì)量/元寶楓種仁粉質(zhì)量×100

1.2.2 種子萌芽處理及萌芽率的測定 選取飽滿的元寶楓種子,進(jìn)行無菌消毒,置于45 ℃烘箱中30 min,然后再在25 ℃生化培養(yǎng)箱中放置36 h(每隔6 h換一次滅菌水)進(jìn)行催芽處理;將處理后的元寶楓種子均勻放置在平皿中,并分別在4、15、25 ℃下避光培養(yǎng),每隔3 d 查看一下種子的萌發(fā)情況,并對其進(jìn)行記錄,計(jì)算其發(fā)芽率。

1.2.3 氣相色譜(GC)法分析元寶楓種仁萌發(fā)前后神經(jīng)酸含量變化 將萌發(fā)前后的元寶楓種仁去殼,超聲破碎后取混勻的神經(jīng)酸油樣0.6 mL于15 mL離心管中,加入5 mL正己烷,搖勻,再加入0.25 mL 2 mol/L KOH-CH3CH2OH溶液,65 ℃恒溫孵育1 h,400 r/min搖動(dòng)。冷卻至室溫,靜置20 min,取上清。

選用色譜柱為HP-5,汽化室溫度270 ℃,氫火焰離子化檢測器(FID)溫度320 ℃,色譜柱溫度200 ℃,載氣為高純氮?dú)?分流比為1∶50,進(jìn)樣量為1.0 μL。

程序升溫:初始溫度200 ℃,以2 ℃/min升至230 ℃,再以8 ℃/min升至270 ℃,保持15 min。

1.2.4 MTT法檢測元寶楓油對神經(jīng)細(xì)胞的作用 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,收集細(xì)胞,稀釋細(xì)胞濃度為1×105/mL的C6細(xì)胞100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別加入5×10-7、5×10-8、5×10-9、5×10-10g/mL不同濃度梯度的神經(jīng)酸標(biāo)品、對照組(DMSO)、元寶楓種仁油,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,用MTT法在490 nm波長測定細(xì)胞密度。增殖倍數(shù)的計(jì)數(shù)公式如式(2)所示(A代表吸光度):

式(2)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1元寶楓油超聲提取方法的建立

2.1.1 超聲功率的選擇 由圖1可知,其他條件不變,隨著超聲波功率的增大,元寶楓種仁油得率增加,在超聲功率200 W時(shí),油脂得率最大,達(dá)到28.88%±3.11%。隨著功率繼續(xù)增加,油脂得率反而下降。液體空化作用越強(qiáng)烈,植物細(xì)胞壁破裂越容易,從而分子擴(kuò)散速度越大,加快了脂溶性物質(zhì)的溶出速度。但當(dāng)空化趨于飽和時(shí),即超過200 W功率,得率會略有所下降。

圖1 不同超聲功率對得率的影響Fig.1 The impact of different ultrasonic power for oil extraction rate

2.1.2 超聲溫度的選擇 超聲溫度對元寶楓種仁油得率的影響如圖2所示。在25 ℃時(shí),油脂得率最大,達(dá)到37.46%±4.40%。但當(dāng)超聲溫度超過25 ℃后,油脂得率呈現(xiàn)下降趨勢,可能由于超聲溫度過高,從而加快了溶劑揮發(fā),導(dǎo)致油脂滲出率降低。

圖2 不同超聲溫度對得率的影響Fig.2 The impact of different ultrasonic temperature for oil extraction rate

2.1.3 料液比的選擇 由圖3可知,在一定物料的前提下,隨著料液比例增加,種仁粉與溶劑的接觸面濃度差增大,脂溶性成分滲出率增大。當(dāng)達(dá)到1∶12時(shí),油脂得率最大,達(dá)到37.59%±3.46%。此后,油脂浸出幾乎飽和,使得浸出率下降。

圖3 不同料液比對得率的影響Fig.3 The impact of different solid-liquid ratio for oil extraction rate

圖4 元寶楓種子的萌發(fā)曲線Fig.4 Germination curve of Acer truncatum Bunge seeds

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將元寶楓種仁油的超聲提取參數(shù)分別確定為:超聲功率200 W、超聲溫度25 ℃、料液比1∶12。在此條件下再次重復(fù)驗(yàn)證三次,結(jié)果顯示元寶楓種仁油得率為32.83%±1.85%。

2.2元寶楓種子萌芽條件的確定

文獻(xiàn)報(bào)道[21-23],元寶楓種子適宜在較低溫度下萌發(fā),故本文摸索了元寶楓種子發(fā)芽的最佳溫度,分別測定了4、15、25 ℃三個(gè)溫度下,42 d內(nèi)200粒元寶楓種子的發(fā)芽率。通過對不同天數(shù)萌發(fā)種子計(jì)數(shù),本文繪制了元寶楓種子在三個(gè)不同培養(yǎng)溫度下的發(fā)芽率曲線,由圖4可知,元寶楓種子在4 ℃下發(fā)芽率最高,而且生長狀況良好。故本文選擇4 ℃作為元寶楓的發(fā)芽溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3元寶楓種仁萌發(fā)前后神經(jīng)酸含量變化分析

本研究推測在元寶楓種子萌發(fā)中很可能伴有神經(jīng)酸含量的增加,為證實(shí)這一點(diǎn),本文利用氣相色譜法檢測了其萌發(fā)前后的含量差異。由神經(jīng)酸標(biāo)品的氣相色譜分析可知,神經(jīng)酸的保留時(shí)間約為21.5 min,如圖5(a)所示。故本文比對了萌發(fā)前后元寶楓種仁油中,神經(jīng)酸含量的差異如圖5(b、c)所示。對比萌發(fā)過程中,神經(jīng)酸含量變化,萌發(fā)前,1 g的元寶楓種仁可以提取805.86 μg神經(jīng)酸;萌發(fā)后,1 g的元寶楓種仁可以提取1245.81 μg神經(jīng)酸。結(jié)果表明,萌發(fā)后的元寶楓種仁油中神經(jīng)酸含量上升,約達(dá)到萌發(fā)前1.5倍。從表達(dá)水平證明了元寶楓種子的萌發(fā)過程中長鏈不飽和脂肪酸的含量也是隨之增加的。

圖5 萌發(fā)前后元寶楓種仁油的氣相色譜分析Fig.5 The analysis of nervonic acid in the Acer truncatum Bunge oil before and after germination by gas chromatography注:a.神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品;b.萌發(fā)前元寶楓種仁油;c.萌發(fā)后元寶楓種仁油。

2.4 MTT法檢測元寶楓種仁油對神經(jīng)細(xì)胞的作用

文獻(xiàn)報(bào)道[24-27],神經(jīng)酸對神經(jīng)細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。故為了探討元寶楓萌發(fā)后種仁油是否能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖,本文利用MTT法檢測了元寶楓萌發(fā)前后種仁油處理的C6神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活性。結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品可劑量依賴性地促進(jìn)C6神經(jīng)細(xì)胞增殖。在均為1×10-7(V/V)用量下,未萌發(fā)的元寶楓種仁油未能促進(jìn)C6神經(jīng)細(xì)胞增殖,而萌發(fā)后的元寶楓種仁油,則有明顯的促進(jìn)作用,究其原因,可能是萌發(fā)前神經(jīng)酸含量較低而萌發(fā)后神經(jīng)酸含量升高有關(guān)。

圖6 萌發(fā)前后元寶楓種仁油對C6神經(jīng)細(xì)胞增殖能力的影響Fig.6 The effect of Acer truncatum Bunge oil before and after germination on the proliferation of C6 nerve cells注:a.神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品;b.萌發(fā)前后的元寶楓種仁油。

3 結(jié)論

本論文以元寶楓種仁為研究對象,首先確定了元寶楓種仁油的超聲提取條件為超聲功率200 W、超聲溫度25 ℃、料液比1∶12,在此條件下元寶楓種仁油得率為32.83%±1.85%。對萌發(fā)前后種仁油的性質(zhì)進(jìn)行了分析,在此研究過程中得到如下結(jié)論:元寶楓種子在4 ℃下發(fā)芽率最高,而且生長狀況良好;萌發(fā)后的元寶楓種仁油中神經(jīng)酸含量有明顯上升;以神經(jīng)酸標(biāo)準(zhǔn)品為對照,發(fā)現(xiàn)萌發(fā)后的元寶楓種仁油能夠增強(qiáng)C6細(xì)胞的細(xì)胞活性。這些研究提示低溫促萌發(fā)處理或許可以作為提高元寶楓提取制備神經(jīng)酸得率的一個(gè)有效的前處理手段,從而為相關(guān)藥品及功能食品的研發(fā)提供了新的參考。此外,本研究也為深入了解元寶楓種仁萌發(fā)過程中的脂肪酸的生物合成奠定了一定基礎(chǔ)。

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UltrasonicextractionofAcertruncatumBungeoilandtheanalysisofthenervonicacidcontentduringthegermination

YANLi-hua1,CHENDong-ju1,LIqian1,ZHANGChuan1,SIChuan-ling2,3,ZHANGTong-cun1,LUOXue-gang1,*

(1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of the Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Tianjin Key Laboratory of Pulp & Paper,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;3.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China)

Firstly,the effect of ultrasonic power,extracting temperature and the solid-liquid ratio on oil yield ofAcertruncatumBunge oil was established. The appropriate temperature of artificial germination of seeds was also investigated. The content of nervonic acid in the seeds oil was detected by GC analysis. The effect of the seed oil on the proliferation of nerve cells was detected by MTT. As the results shown,the optimal extraction conditions were as follows:ultrasonic power 200 W,extracting temperature 25 ℃,the solid-liquid ratio 1∶12. The seeds ofAcertruncatumBunge were germinated at 4 ℃. The results of GC analysis showed that the content of nervonic acid was significantly increased to 1.5 fold after the germination. Nervonic acid could promote the growth of nerve cells,and the oil from the germinated seeds ofAcertruncatumBunge was stronger than the dormant seed oil.

AcertruncatumBunge;ultrasonic-assisted extraction;nervonic acid;germination;proliferation

2017-01-03

閆莉華(1990-)，女，研究生，研究方向：功能因子的研究與開發(fā)，E-mail：yanlihua90@163.com。

*通訊作者:羅學(xué)剛(1981-)，男，博士，教授，研究方向：益生菌及功能產(chǎn)品開發(fā)與分子藥理學(xué)研究，E-mail：luoxuegang@tust.edu.cn。

林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)院)開放基金(TGB2016002)；林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))開放基金(K2013101)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2012AA022108)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(IRT1166)；天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))開放基金(2016IM003)。

TS255.1

:B

:1002-0306(2017)16-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.033