楊文強(qiáng)鐘新生黃炎馬威楊家耀

1.武漢市第一醫(yī)院中心實驗室（湖北 武漢，430030） 2.武漢市第一醫(yī)院檢驗科 3.武漢市第一醫(yī)院消化內(nèi)科

脂肪乳灌胃誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠肝纖維化及β-catenin mRNA表達(dá)的影響*

楊文強(qiáng)1鐘新生2黃炎2馬威1楊家耀3△

1.武漢市第一醫(yī)院中心實驗室（湖北 武漢，430030） 2.武漢市第一醫(yī)院檢驗科 3.武漢市第一醫(yī)院消化內(nèi)科

目的：用脂肪乳灌胃方法建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，觀察不同時間點非酒精性脂肪肝大鼠肝組織病理改變與Wnt信號通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的聯(lián)系。方法：20只wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，造模組16只，按10ml/kg劑量灌胃脂肪乳（25%豬油，10%膽固醇，1%丙塞優(yōu)，2%脫氧膽酸鈉）；空白組4只，按相同劑量灌胃生理鹽水。分別于第4、6、8、10周時隨機(jī)從造模組選4只大鼠，稱重麻醉后采血，檢測生化指標(biāo)；取肝組織冰凍切片進(jìn)行油紅O染色；肝組織石蠟切片HE染色后，鏡下觀察并進(jìn)行NAS（非酒精性脂肪性肝病活動度評分）評分；分別檢測不同時間點大鼠肝組織Wnt3αmRNA、β-cateninmRNA、Col1a1mRNA（膠原蛋白I）表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠4周時TC（總膽固醇）開始顯著增高（P＜0.01），8周時TG、LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）開始顯著增高（P＜0.05）。模型組大鼠4周時，肝細(xì)胞腫脹，輕度脂肪肝變。6周時，肝臟指數(shù)開始顯著增高（P＜0.05），炎性細(xì)胞浸潤明顯，中度脂肪肝變。8周時肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴（大泡性為主），重度脂肪肝變，見纖維增生。10周時，肝細(xì)胞氣球樣變，伴點狀壞死，見明顯的纖維增生。模型組大鼠隨造模時間延長，Wnt3α、β-catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)顯著增高。結(jié)論：Wnt經(jīng)典信號通路介導(dǎo)了本模型脂肪乳灌胃誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)程，10周時出現(xiàn)肝纖維化。

非酒精性脂肪性肝??；脂肪乳；大鼠模型；β-catenin

Fund sourcesDu JianMin studioThe construction project of inheriting the studio of national famous traditional Chinesemedicine experts in 201

圖1 各組大鼠肝組織病理圖(HE,×200)

圖2 各組大鼠肝組織病理圖(油紅O染色×200)

近年來，隨著我國生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的發(fā)病率逐漸增高，并有年輕化趨勢［1］，嚴(yán)重威脅人類健康。研究表明，大量高脂、高糖的攝入是導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生的重要因素［2］。我們采用脂肪乳灌胃方法制備NAFLD大鼠模型，觀察不同時間點大鼠肝組織病理改變與Wnt經(jīng)典信號通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的聯(lián)系，以期為今后研究提供良好的基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠20只，雄性，SPF級，購于湖北省動物中心（動物合格證編號No.42000600013948），動物實驗完成于武漢市第一醫(yī)院SPF動物室（湖北省實驗動物設(shè)施使用證號No.00138894）。動物室內(nèi)環(huán)境溫度21±1℃，濕度50± 15%，12h明暗交替。動物自由飲去離子水，飼喂經(jīng)輻照消毒的維持飼料（北京華阜康公司提供）。

1.2 實驗試劑及藥物 膽固醇、吐溫80、1，2-丙二醇、甲醇均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20120409、20151105、20160114、20130608；丙硫氧嘧啶（德國Lonapham Rudolf Lohmann GmbH KG生產(chǎn)，進(jìn)口藥品注冊證號：H20130868，批號1413890）；脫氧膽酸鈉（索萊寶公司批號No.1226A0210）；油紅O染液（武漢賽維爾，批號：160839）；豬油（市售）；肌酐（Cr）檢測試劑盒（酶法）（積水醫(yī)療株式會社，批號：824RBN）；以下試劑均購于貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)（蘇州）有限公司：總膽固醇（TC）檢測試劑盒（酶法）批號AUZ3913、甘油三酯（TG）檢測試劑盒（GPO-POD法）批號AUZ3765、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）批號AUZ3907、（HDL-C）高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒（直接法）批號AUZ3572、低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒（直接法）批號AUZ3564、總蛋白（TP）測定試劑盒（雙縮脲法）批號AUZ3710、白蛋白測定試劑盒（溴甲酚綠法）批號AUZ3752、尿酸測定試劑盒（尿酸酶-過氧化物酶法）

批號AUZ3903、尿素（BUN）測定試劑盒（尿素酶-谷氨酸脫氫酶法）批號AUZ3853，引物合成于武漢英駿生物科技有限公司，分子生物學(xué)試劑購于上海生工。

1.3 實驗設(shè)備 全自動生化分析儀、冰凍切片機(jī)、CX41型奧林帕斯顯微鏡、DHG-9023A型恒溫烘箱（上海恒一）、RM2235型石蠟切片機(jī)（萊卡顯微系統(tǒng)有限公司）、TB-718D石蠟包埋機(jī)（湖北泰維科技）、DFC295型IMS圖像分析系統(tǒng)（武漢華聯(lián)科）、尼康D5100數(shù)碼相機(jī)、Applied Biosystems Veriti型PCR儀、Bio凝膠成像分析儀。

1.4 脂肪乳灌胃制備大鼠脂肪肝模型［3，4］20只大鼠先隨機(jī)分為兩組：造模組16只，每日上午灌胃脂肪乳；空白組4只，灌胃生理鹽水。連續(xù)12周。脂肪乳由A液與B液混勻，加水至100ml即得，灌胃劑量為1ml/100g大鼠，每日上午10：00灌胃，每周按體重調(diào)整灌胃劑量。A液：25g豬油加熱溶解后，加入10g膽固醇，攪拌溶解后加入1g研成粉末的丙賽優(yōu)，充分混勻后加入25ml吐溫80，混勻后備用；B液：向30ml水中加入20ml丙二醇，加熱至60℃，再加入2g研成粉末的脫氧膽酸鈉，混勻后備用。

1.5 樣本采集 在實驗過程中，分別于脂肪乳灌胃的第4、6、8、10周分別取4只大鼠，按40mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉，腹主動脈采血，肝素抗凝，分離血漿，全自動生化分析儀上檢測血脂等指標(biāo)；取部分肝組織，4%多聚甲醛固定備用；部分肝組織冰凍切片并行油紅O染色；部分肝組織－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 大鼠肝組織HE染色與油紅O染色 組織經(jīng)4%多聚甲醛固定兩天后，常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋切片；組織切片分別經(jīng)100%二甲苯、75%二甲苯、100%乙醇、85%乙醇浸泡脫蠟至水；蘇木精染液5min染色，流水沖洗1.5min；1%鹽水酒精3sec，水洗2sec，促藍(lán)液返藍(lán)6sec，流水沖洗20sec；0.5%伊紅染色2min，蒸餾水稍洗2sec；脫水，中性樹膠封片。

油紅O染色：冰凍切片干燥60min后，用10%甲醛4℃固定10min；傾去固定液，雙蒸水洗兩次，放置室溫干燥45min；用已經(jīng)預(yù)熱的油紅O染液60～65℃染色15min；80%丙二醇分化2～5min（鏡下觀察背景接近無色為止）；雙蒸水洗3次；蘇木素復(fù)染40sec，水洗3min；鏡下觀察，拍照。鏡下觀察，脂類物質(zhì)為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

1.7 病理分析與評價 根據(jù)《非酒精性脂肪性肝病診療指南》（2010年修訂版）［5］內(nèi)容，對肝組織切片在病理學(xué)和形態(tài)學(xué)上進(jìn)行評價，按NASH臨床研究評價體系進(jìn)行NAS評分并統(tǒng)計分析。NAS評分0～8分：①肝細(xì)胞脂肪變：0分（＜5%）、1分（5%～33%）、2分（34%～66%）、3分（＞66%）；②小葉內(nèi)炎癥（20倍鏡下計數(shù)：0分（無）、1分（＜2個）、2分（2～4個）、3分（＞4個）；③肝細(xì)胞氣球樣變：0分（無）、1分（少見）、2分（多見）。NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分可診斷為NASH，介于兩者之間者為NASH可能。

1.8 RT-PCR方法檢測Wnt3α、β-catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)

Trizol提取法提取肝組織總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動分析成像系統(tǒng)上進(jìn)行灰度（IOD）掃描分析，再利用相應(yīng)的GAPDH灰度值為參照，計算各組各指標(biāo)mRNA表達(dá)的相對強(qiáng)弱。引物序列及擴(kuò)增條件：Wnt3α引物：上游5'-ATTCCATTCCCAGAGCCTGC-3'，下游5'-CAGGAAGCTCTTGTGGCAGA-3'，產(chǎn)物長度134bp，退火溫度58℃，循環(huán)次數(shù)30；β-catenin引物：上游5'-CTTGGCTATTACGACAGACT-3'，下游5'-CAGCACCTTCAGCACTC-3'，產(chǎn)物長度163bp，退火溫度56℃，循環(huán)次數(shù)30；Col1α1引物：上游5'-TACAGCACGCTTGTGGATG-3'，下游5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTA-3'，產(chǎn)物長度190bp，退火溫度56℃，循環(huán)次數(shù)30；GAPDH引物：上游5'-GGTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'，下游5'-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'，產(chǎn)物長度292bp，退火溫度60℃，循環(huán)次數(shù)30。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗，所用數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。再進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗，若方差齊則接受方差結(jié)果并用LSD法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊，則用Tamhane法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組大鼠生化指標(biāo)比較 經(jīng)檢驗，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。Levene檢驗結(jié)果顯示，體重、肝指數(shù)、BUN、Cr、CD、TG等指標(biāo)方差齊（P值分別為0.071，0.137，0.130，0.088，0.404）；ALT、TP、TC、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)方差不齊（P值分別為0.005，0.031，0.004，0.039，0.000）。如表1所示，與空白組大鼠比較，4w、6w、8w、10w時間點模型動物體重均顯著降低（P值均為0.000），BUN顯著增高（P值為0.004，0.000，0.002，0.000）；6w、8w和10w時間點大鼠肝指數(shù)顯著增高（P值為0.003，0.001，0.000）；8w和10w時間點大鼠TC顯著增高（P值為0.008，0.004）；8w和10w時時間點大鼠TG顯著增高（P值為0.000，0.000）；10w時間點大鼠TP、HDL-C、LDL-C含量均顯著增高（P值分別為0.047，0.001，0.005，0.000）。與4w時間點大鼠比較，8w及10w時間點大鼠肝指數(shù)顯著增高（P值0.034，0.012），TG顯著增高（P值0.000，0.000），TC顯著增高（P值0.021，0.010）；10w時間點大鼠體重、Cr、HDL-C、LDL-C均顯著增高（P值分別為0.013，0.002，0.002，0.004）。

表1 各組不同時間生化指標(biāo)比較（±s，n＝4）

表1 各組不同時間生化指標(biāo)比較（±s，n＝4）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與人模型組4W時比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別體重（g）肝指數(shù) ALT（u/L） TP（g/L） BUN（mmol/L）空白組 450± 23 0.032± 0.004 60± 6 58.3± 6.7 5.80± 0.61模型組4w 305± 9** 0.039± 0.005 234± 40*72.3± 3.9 7.98± 1.20**模型組6w 305± 41** 0.047± 0.009**268± 78 75.6± 9.9 8.63± 0.95**模型組8w 325± 25** 0.049± 0.007**＃120± 23＃74.0± 4.9 8.20± 1.00**模型組10w 360± 11**＃0.051± 0.005**＃227± 56 77.2± 5.0*8.83± 0.49**F值（P）19.314（0.000）6.859（0.002）7.442（0.002）組KLJ Cr（umol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL－C（mmol/L）LDL－C（mmol/L）0.31±空白組38.3± 10.3 1.40± 0.18 0.99± 0.17 0.88± 0.140.06模型組4W 38.5± 4.3 4.60± 1.44*0.53± 0.24 0.95± 0.28 3.50± 1.53模型組6W 38.0± 7.2 11.15± 3.88*1.08± 0.39＃1.73± 0.54 8.60± 2.56模型組8W 38.8± 6.0 16.75± 3.26**＃2.33± 0.46**＃＃2.31± 0.43 11.48± 4.21*模型組10W 14.20± 0.43**＃＃F值（P）57.8± 6.5**＃＃24.55± 4.00**＃2.40± 0.39**＃＃2.85± 0.35**＃＃5.590（0.004）23.551（0.000）

2.2 兩組大鼠NAS評分比較 經(jīng)判研，NAS評分結(jié)果如下：4W、6W、8W、10W時間點模型大鼠NAS評分依次為（3.25± 0.50）、（4.00±0.817）、（5.00±0.817）、（7.00±0.817），均顯著增高，與空白組NAS（0.25±0.50）比較，P值均為0.000。10W時間點模型大鼠NAS評分顯著高于4W、6W、8W時間模型大鼠（P值分別為0.000，0.000，0.001）。

2.3 兩組大鼠HE染色及油紅O染色結(jié)果 兩組大鼠石蠟切片的HE染色見插頁圖1，冰凍切片的油紅O染色見插頁圖2。光鏡下HE染色可觀察到，空白組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤，未見肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝索、肝血竇清晰，見少量炎性細(xì)胞浸潤；油紅O染色未見脂肪顆粒。模型組大鼠造模4周時，肝小葉結(jié)構(gòu)稍見紊亂，肝細(xì)胞稍腫脹；油紅O染色見肝細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)小泡性脂肪病變。造模6周時，肝細(xì)胞脂肪病變加重，肝細(xì)胞內(nèi)見大小不等脂滴，小泡性脂滴＞大泡性脂滴，肝細(xì)胞體積增大，肝索排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤明顯。造模8周時，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，以大泡性脂肪病變?yōu)橹鳎手囟戎靖巫?，見少量纖維增生。造模10周時，肝細(xì)胞氣球樣變，呈重度脂肪肝變，肝細(xì)胞肥大，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，并伴肝細(xì)胞點狀壞死，見明顯的纖維增生。

2.4 兩組大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)比較 如表2及圖3所示，經(jīng)統(tǒng)計各組之間Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)有顯著差異（F值為10.268，12.161，10.694，P＝0.000）。與空白組比較，模型組6week、8week、10week組Wnt3α mRNA表達(dá)增高（P＝0.011，0.001，0.000），模型組8week、10week組β－cateninmRNA表達(dá)增強(qiáng)（P＝0.001，0.000），模型組6week、8week、10week組Col1α1 mRNA表達(dá)顯著增高（P＝0.023，0.007，0.000）；與模型組4week組比較，模型組8week、10week組Wnt3αmRNA表達(dá)增高（P＝0.012，0.011），β－catenin mRNA表達(dá)亦增強(qiáng)（P＝0.005，0.000），模型組10week組Col1α1 mRNA表達(dá)顯著增高P＝0.000）。

表2 兩組大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)比較（±S，n＝4）

表2 兩組大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)比較（±S，n＝4）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組4w比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 Wnt3αβ－catenin Col1α1空白組0.16±0.09 0.37±0.05 0.14±0.06模型組4w 0.24±0.09 0.40±0.07 0.20±0.11模型組6w 0.35±0.10* 0.45±0.08 0.28±0.06*模型組8w 0.42±0.08**＃ 0.56±0.13**＃＃ 0.31±0.06**＃模型組10w 0.54±0.11**＃＃ 0.66±0.07**＃＃ 0.47±0.12**＃＃F值 10.268 12.161 10.694（P）（0.000）（0.000）（0.000）

圖3 兩組大鼠Wnt3α、β－catenin、Col1α1 mRNA表達(dá)比較（A.空白對照組；B.造模4周；C.造模6周；D.造模8周；E.造模10周）

3.討論

由于非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)病率逐年上升，1/3的美國成年人有NAFLD［6］，歐洲的患病率為20%～30%［7］，中國為5%～24%［8］，印度城市人群為16%～32%［9］，這引起越來越多的研究者的關(guān)注。建立適當(dāng)?shù)?、與人類相似的該疾病動物模型，是研究NAFLD的關(guān)鍵問題。目前，復(fù)制NAFLD動物模型的方法有很多，如高脂飼料飼喂、脂肪乳灌胃、高糖高脂飼料飼喂、復(fù)合因素誘導(dǎo)以及特殊品系的先天性遺傳性模型等［10］。

Wnt是一種分泌型糖蛋白，富含半胱氨酸殘基，主要通過自分泌或旁分泌的方式激活膜受體而發(fā)揮作用，Wnt信號通路活化的重要起始信號是Wnt蛋白表達(dá)。在進(jìn)化過程中Wnt蛋白表達(dá)高度保守，并在多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Wnt3α處理的HSC表達(dá)α-SMA（α平滑肌肌動蛋白）及I型膠原上調(diào)，活化HSC而進(jìn)一步加速肝纖維化［11］；siRNA沉默HSC－T6細(xì)胞β-catenin表達(dá)，使得Ⅰ、Ⅲ型膠原的分泌減少，從而延緩肝纖維化的發(fā)展［12］；用HINT1（TGF-β/Smad和Wnt/βcatenin通路的共同抑制劑）干預(yù)家兔肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)H1NT1可增強(qiáng)Smad7的基因表達(dá)，降低Smad3和cyclin D1的基因表達(dá)水平，阻抑肝臟組織中α-SMA的表達(dá)而延緩肝纖維化進(jìn)程［13，14］。

我們采用脂肪乳灌胃的方法制備NAFLD模型，相對于高脂飼料飼喂模型有能按體重準(zhǔn)確控制脂肪乳飼喂量的優(yōu)勢。本模型在第6W時肝指數(shù)開始顯著增高（P＜0.05），TC在4周時顯著增高（P＜0.05），TG與LDL-C在第8W時顯著增高（P＜0.01）；病理結(jié)果顯示，在4W時呈現(xiàn)輕度脂肪肝變，6W時呈中度脂肪肝變，8W時為重度脂肪肝變伴少量纖維化，10W時重度脂肪肝伴纖維化。纖維化程度隨造模時間延長而加深，同時，Wnt/β-catenin信號通路中，起始信號Wnt3α基因，關(guān)鍵點βcatenin基因及下游靶基因Col mRNA表達(dá)增強(qiáng)，說明本模型Wnt經(jīng)典信號通路啟動并介導(dǎo)了纖維化的形成，通路中具體哪些因子參與介導(dǎo)還需要更進(jìn)一步細(xì)致的研究。

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Effect of hepatic fibrosis and expression of Wan signaling pathway total gene in rats w ith nonalcoholic fatty liver disease by fat emulsion

YANGWen-qiang1，ZHONG Xin-sheng2，YANG Jia-yao3*etal.1.The center Laboratory，the No.1 Hospital of WuHan，（Wuhan Hubei，430030）China

Objectiue To establish the ratmodel of nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）by fat emulsion lavaged.M ethods：Twenty wistar ratswere randomly divided into two groups：model group（sixteen rats）were fed with fat emulsion（25%lard，10%cholesterol，1%acrylic，2%sodium deoxycholic acid）by 10ml/kg dose，control group（four rats）were fed with normal saline by the same dose.Four rats were selected from model group randomly in the fourth，sixth，eighth，tenth week and drew blood after weighted，anaesthetized to detectbiochemical indicators.Frozen section of liver tissue was stained by oil red O，paraffin section of liver tissue was stained by HE，and observed in themicroscopic，scored according to NAS（NAFLD activity scores），and the expression ofWnt3α，β-catenin，Col1a1 mRNA were detected at different time points.Results ①Biochemical results showed that compared with control group，T-Chol（total cholesterol）began to increase significantly（P＜0.01）in 4 weeks，TG（triglycerides），LDL-C（Low density lipoprotein cholesterol）began to increase significantly（P＜0.05）in 8 weeks.②Pathologic results showed thathepatic cell swelling，mild fatty liver in 4 weeks.Liver index began to increase significantly（P＜0.05）in 6 weeks，and itwas degreed ofmoderate fatty liver.Liver cells appeared a large number of lipid droplets（big bubble），severe fatty liver and fibrous hyperplasia was found in 8 weeks.In 10 weeks，all of liver index increased，there was hepatocyte ballooning change with dot necrosis，obvious hyperplasia of fibre.③Gene detection results showed that theWnt3 alpha，beta-catenin，Col1 alpha 1mRNA expression increased significantlywith the prolongation ofmodeling time.Conclusion Classic Wnt signal pathwaymediated the liver fibrosis process induced by fat emulsion lavage in thismodel，and Severe fatty livermodelwasmade by filling stomach fatmilk in 8 weeks，liver fibrosis occurred in 10 weeks.

Nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）；fat emulsion；ratmodel；β-catenin

2017－04－10 編輯：黃育華）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.014

2013年全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目——杜建民工作室， △通訊作者，E－mial：54014317＠qq.com，Tel：18571775557