蘆丁在水溶液中的降解動(dòng)力學(xué)研究△

霍紅娜，王萌，孫立麗，張慧杰，任曉亮*，鄧雁如，戚愛(ài)棣

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，天津 300193)

·基礎(chǔ)研究·

蘆丁在水溶液中的降解動(dòng)力學(xué)研究△

霍紅娜1，王萌2，孫立麗1，張慧杰1，任曉亮1*，鄧雁如1，戚愛(ài)棣1

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，天津300193)

目的：研究蘆丁水溶液在不同的pH、溫度、離子強(qiáng)度、初始濃度條件下降解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征。方法：采用高效液相色譜法考察不同條件下蘆丁含量隨時(shí)間的變化，利用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的方法計(jì)算蘆丁在不同環(huán)境下的降解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，預(yù)測(cè)其半衰期(t1/2)和活化能。結(jié)果：蘆丁在不同環(huán)境條件下的降解反應(yīng)均遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，在pH=3環(huán)境中最為穩(wěn)定，強(qiáng)酸堿性條件下較容易降解，pH=9時(shí)的室溫條件下半衰期為57.75h，活化能為39.3kJ·mol-1，隨著離子強(qiáng)度的增加降解速率也隨之加快，但初始濃度對(duì)其降解影響不大。結(jié)論：蘆丁在酸性水溶液中較為穩(wěn)定，隨著pH的增大降解速率逐漸加快，呈現(xiàn)pH和溫度依賴型，提示蘆丁的使用和保存適宜在低溫偏酸性條件下，避免堿性環(huán)境和高溫條件。

蘆?。凰芤海唤到鈩?dòng)力學(xué)

蘆丁(Rutin)，又名蕓香苷、維生素P、紫槲皮苷，是槲皮素(Quercentin)的3-O-蕓香糖苷，屬于黃酮醇類。主要存在于豆科植物槐SophorajaponicaL.的花蕾(槐米)、果實(shí)(槐角)，蕓香科植物蕓香RutagraveolenslensL.全草，金絲桃科植物紅旱蓮HypericumascyronL.全草及蓼科植物蕎麥FagopyrumesculentumMoench的籽苗中。研究表明，蘆丁具有抗氧自由基活性[1]、抗脂質(zhì)過(guò)氧化[2]、血管保護(hù)[3]、抗菌[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]、提高免疫力[6]、抗腫瘤[7]、降糖[8]、促進(jìn)泌乳[9]、腎保護(hù)[10]等多種活性，臨床上廣泛用于防止腦出血、高血壓等心腦血管疾病。由于蘆丁為黃酮苷類化合物，其在水溶液中苷鍵可能發(fā)生水解，酚羥基可能被氧化而降解。本實(shí)驗(yàn)依照ICH指導(dǎo)原則，采用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法研究了蘆丁水溶液在不同pH、溫度、離子強(qiáng)度及初始濃度等條件下的降解規(guī)律，以期為含有蘆丁的藥物的合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1試劑和藥品

蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707)；甲醇(色譜純，SPECTRO，美國(guó)TEDIA)；純水(由Milli-Q純水器制備)；甲酸(色譜純，美國(guó)TEDIA)；NaOH(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；HCl(分析純，天津化學(xué)試劑一廠)。

1.2儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)(600EHPLCpump，2487DualλAbsorbanceDetecter，Empower色譜工作站)；AX205分析天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)；XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；恒溫水浴(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 降解規(guī)律的研究

2.1HPLC色譜條件

色譜柱：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸-甲醇(58∶42，V/V)；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；溫度：25℃。在該色譜條件下，蘆丁可在10min內(nèi)完成檢測(cè)(保留時(shí)間8.2min)，降解產(chǎn)物不會(huì)干擾測(cè)定。配制系列濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.1292×104X-2012(r=0.9996)，結(jié)果表明峰面積在蘆丁質(zhì)量濃度0.2～10.0μg·mL-1線性關(guān)系良好。取質(zhì)量濃度為2.0μg·mL-1的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得蘆丁峰面積的RSD=0.8%，結(jié)果表明此法精密度良好。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品6.3mg，置于10mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制得到濃度為0.63mg·mL-1的蘆丁儲(chǔ)備液。

精密吸取上述蘆丁儲(chǔ)備液200μL，置于10mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制得到濃度為12.6μg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.3蘆丁穩(wěn)定性研究

2.3.1pH值對(duì)穩(wěn)定性的影響 為了考察pH值對(duì)蘆丁穩(wěn)定性的影響，采用HPLC測(cè)定了一段時(shí)間內(nèi)蘆丁在不同pH值水溶液中的含量變化，得到不同pH值下蘆丁的降解動(dòng)力學(xué)曲線并計(jì)算降解速率常數(shù)k。

2.3.1.1樣品溶液的制備pH2～6水溶液：分別向100mL純水中加入適量HCl，由精密pH計(jì)測(cè)定pH值，配制成pH2～6水溶液。

pH7水溶液：為純水，由精密pH計(jì)測(cè)定pH值為7。

pH8～11水溶液：分別向100mL純水中加入適量NaOH，由精密pH計(jì)測(cè)定pH值，配制成pH8～11水溶液。

精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液(0.63mg·mL-1)200μL于10mL棕色量瓶中，用事先配制好的不同pH值的水溶液定容至刻度，搖勻即得，該樣品溶液中蘆丁的起始濃度為12.6μg·mL-1。

2.3.1.2樣品的測(cè)定與結(jié)果 為了排除光照和溫度的影響，所有蘆丁樣品均保存在棕色容量瓶中。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，蘆丁在不同pH水溶液中的降解速率相差較大，當(dāng)溶液pH在2～10時(shí)，樣品室溫放置，蘆丁降解速度較為緩慢，因此將上述的樣品放入80℃水浴中，每隔一定時(shí)間，精密吸取樣品溶液10μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算樣品中蘆丁的含量。見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁液相色譜圖

在蘆丁質(zhì)量濃度(12.6μg·mL-1)和溫度恒定的條件下，以ln(Ct/C0)為縱坐標(biāo)，水解時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到在不同pH值條件下蘆丁的降解動(dòng)力學(xué)曲線，見(jiàn)圖2。通過(guò)線性回歸運(yùn)算，得到在不同pH值條件下蘆丁的降解速率常數(shù)及其他動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯觯袑?shí)驗(yàn)條件下的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的相關(guān)系數(shù)r<0.960，證明蘆丁在不同pH值水溶液中的降解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

圖2 不同pH值下蘆丁的降解動(dòng)力學(xué)曲線

pHk/min-1rt1/2/h20.00100.96211.5530.00010.986115.540.00060.96019.2550.00170.9626.7960.00180.9856.4270.00310.9903.7380.00740.9671.5690.00610.9871.89100.01890.9900.13

為了更直觀地表示pH對(duì)蘆丁在水溶液中降解速率的影響，以ln(k)為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)作圖，得到pH值與蘆丁降解速率的關(guān)系圖(見(jiàn)圖3)?？芍J丁在酸性條件下(pH=3)比較穩(wěn)定，在堿性條件下，特別是強(qiáng)堿條件下易降解。推測(cè)出水解反應(yīng)可能是氫氧根離子催化下的反應(yīng)。在pH 3～10下，隨著pH的增大，降解速率加快，表明堿性溶液中的降解反應(yīng)可能是氫氧根離子的催化作用；且在pH 2～3下，降解速率隨pH的增加而降低，表明在酸性溶液中，蘆丁也會(huì)發(fā)生降解反應(yīng)，可能是氫離子的催化作用，但是反應(yīng)強(qiáng)度明顯弱于堿性條件下。

圖3 80 ℃下蘆丁在不同pH值下降解速率常數(shù)比較

2.3.2 溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響

2.3.2.1 樣品溶液的制備 pH 10水溶液的配制：同2.3.1.1項(xiàng)下的方法。

精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液(0.63 mg·mL-1)200 μL于10 mL棕色量瓶中，用pH 10水溶液定容至刻度，搖勻即得，該樣品溶液中蘆丁的起始濃度為12.6 μg·mL-1。

2.3.2.2 樣品的測(cè)定與結(jié)果 將配制好的樣品溶液分別放置于70、80、90 ℃的恒溫水浴中，每隔一定時(shí)間，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算樣品中蘆丁的含量。

以ln(k)為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，得到溫度對(duì)蘆丁降解速率的影響，如圖4所示，通過(guò)阿侖尼烏斯方程可計(jì)算降解反應(yīng)的活化能為39.3 kJ·mol-1。

圖4 不同溫度下蘆丁的降解速率常數(shù)圖

2.3.3 離子強(qiáng)度對(duì)穩(wěn)定性的影響

2.3.3.1 樣品溶液的制備 pH 10水溶液的配制：同2.3.1.1項(xiàng)下的方法。

精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液(0.63 mg·mL-1)200 μL于10 mL棕色量瓶中，用pH 10水溶液定容至刻度，搖勻得樣品1；精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液(0.63 mg·mL-1)200 μL于10 mL棕色量瓶中，加入含有0.5 mol·L-1NaCl的 pH 10水溶液定容至刻度，搖勻得樣品2。

2.3.3.2 樣品的測(cè)定與結(jié)果 將蘆丁樣品保存在棕色容量瓶中，室溫放置。每隔一定時(shí)間，分別精密吸取上述各樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算樣品中蘆丁的含量。

結(jié)果表明，蘆丁在pH 10水溶液和加入0.5 mol·L-1NaCl的水溶液中的降解速率分別為0.009 7、0.024 7 h-1，可以證明Na+、Cl-對(duì)蘆丁的水解反應(yīng)有一定的影響，離子的存在可使蘆丁的降解速率增加155%，降解反應(yīng)變快。

2.3.4 初始濃度對(duì)穩(wěn)定性的影響

2.3.4.1 樣品溶液的制備 pH 10水溶液的配制：同2.3.1.1項(xiàng)下的方法。

精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液(0.63 mg·mL-1)100、200、400 μL分別置于10 mL棕色量瓶中，用pH 10水溶液定容至刻度，搖勻即得，各樣品溶液中蘆丁的起始濃度為對(duì)照品濃度的6.3、12.6、25.2 μg·mL-1。

2.3.4.2 樣品的測(cè)定與結(jié)果 將蘆丁樣品保存在棕色容量瓶中，室溫放置。每隔一定時(shí)間，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆丁峰面積，計(jì)算樣品中蘆丁的含量。

對(duì)降解結(jié)果加以分析，以降解速率常數(shù)對(duì)3個(gè)濃度的樣品濃度進(jìn)行作圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，蘆丁的起始濃度不同，但反應(yīng)速率略微增大，反應(yīng)物初始濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響并不明顯。

圖5 初始濃度對(duì)蘆丁降解速率的影響

3 結(jié)論

研究表明蘆丁在多種物理、化學(xué)環(huán)境中均不穩(wěn)定，且在各條件下的水解作用均遵循(偽)一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。其降解過(guò)程呈現(xiàn)出明顯的pH及溫度依賴性，且初始濃度對(duì)降解速率的影響不明顯。

隨著Na+及Cl-的引入，蘆丁在堿性條件下的降解反應(yīng)速率加快，通常認(rèn)為，離子強(qiáng)度的變化對(duì)非電解質(zhì)的反應(yīng)影響較小，而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能是因?yàn)樨S富離子存在可促進(jìn)OH-進(jìn)攻蘆丁，而促使其

氧化降解所致。

蘆丁的降解速率是pH依賴型的。在強(qiáng)酸及堿性環(huán)境中均不穩(wěn)定，在pH=3水溶液環(huán)境中，蘆丁的穩(wěn)定性最強(qiáng)，隨著溶液堿性的增加，降解反應(yīng)的速度也明顯加快，推測(cè)在酸性條件下可發(fā)生苷鍵的水解，而在堿性條件下發(fā)生氧化及水解反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，隨著溫度升高，蘆丁降解反應(yīng)速度加快，利用阿倫尼烏斯方程計(jì)算其在pH=10的條件下反應(yīng)活化能為39.3 kJ·mol-1，說(shuō)明蘆丁在堿性條件下易降解，該反應(yīng)可在室溫下發(fā)生。

因此，蘆丁及含有蘆丁的相關(guān)藥物應(yīng)該在低溫條件下保藏，在開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)及使用含有蘆丁的藥物時(shí)應(yīng)使用弱酸性的條件，并控制溶劑中存在的離子濃度，避免蘆丁的降解。

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Studies on Degradation Kinetics of Rutin in Aqueous Solution

HUO Hongna1，WANG Meng2，SUN Lili1，ZHANG Huijie1，REN Xiaoliang1*，DENG Yanru1，QI Aidi1

(1.College of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China;2.Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China)

Objective：To investigate the degradation kinetic characteristics of rutin in aqueous solution under different pH and temperatures.Methods：The concentration change of rutin in aqueous solution was determined by HPLC under different pH and temperatures.Base on the chemical reaction kinetic，the parameters of degradation kinetics were calculated under different conditions.The activation energy and half-life were evaluated.Results：The results indicated that thermal degradation kinetic model of rutin in aqueous solution follows first-order degradation kinetic process.The half-life period(t0.5)was 57.75 h under pH 9 in aqueous solution，and the energy of activation(Ea)was 39.3 kJ·mol-1.Conclusion：Rutin was more stable in acidic aqueous solution and low temperature condition.The degradation of rutin can be observed in strong alkali conditions.

Rutin；aqueous solution；degradation kinetics

國(guó)家自然科學(xué)基金面上基金(81473543)

] 任曉亮，副教授，研究方向：藥物分析；Tel：(022)59596221，E-mail：xiaoliang_ren@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.013

2016-05-09)

*[