劉思雨

肖 菁1,2,3

索化夷1,2,3

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心〔西南大學〕，重慶 400715；3. 西南大學重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

傳統(tǒng)泡菜中抗性乳酸菌的篩選及鑒定

劉思雨1,2,3

肖 菁1,2,3

索化夷1,2,3

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心〔西南大學〕，重慶 400715；3. 西南大學重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

以傳統(tǒng)泡菜中分離出的40 株乳酸菌為對象，通過耐酸、抗人工胃液和抗膽鹽試驗，確定傳統(tǒng)泡菜中具有良好抗性的乳酸菌，并使用16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析良好抗性乳酸菌的種屬關系。試驗結果表明，40 株乳酸菌中編號MFR-28和MFR-30兩株菌對人工胃液和膽鹽具有較強的耐受能力，其在人工胃液中的存活率分別為85.21%和90.47%，在0.3%膽鹽中的生長效率分別為11.84%和7.37%；經16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，MFR-28和MFR-30均為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。該研究篩選出的2 株抗性干酪乳桿菌，可作為潛在益生菌進一步探索其生理功能，以期用于開發(fā)益生菌產品。

泡菜；乳酸菌；耐受能力；人工胃液；膽鹽

中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品歷經長時間自然發(fā)酵，其中含有大量未知、有待開發(fā)利用的乳酸菌資源，是篩選益生菌的重要來源[1]。泡菜作為中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，西南地區(qū)居民都有制作泡菜的習慣，而由不同地區(qū)、不同工藝、不同蔬菜制成的泡菜，其中蘊含的乳酸菌菌屬也各有不同。泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群主要為乳桿菌屬和明串珠菌屬[2-3]。有研究[4-5]表明，自泡菜中分離的乳酸菌大多數(shù)性狀優(yōu)良，能作為潛在益生菌。Yosep Ji等[4]通過研究菌株的功能特征及安全性評價，發(fā)現(xiàn)分離自泡菜的5 株植物乳桿菌均能作為潛在益生菌。Lee等[5]自泡菜中分離篩選出一株具有高抗菌活性的植物乳桿菌LHB55，可用于研制一種新型發(fā)酵劑。

益生菌是一類能在人體內產生有益作用的活性微生物，具有增強人體免疫力、調節(jié)胃腸道菌群、防止生殖系統(tǒng)感染、降低血清膽固醇、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[6]，常被用于食品[5]、醫(yī)藥[7]和飼料[8]等領域。當前，中國益生菌研究應用起步較晚，益生菌資源開發(fā)不足，市場上益生菌產品多依賴于國外菌種[9]。充分利用中國現(xiàn)有資源，篩選優(yōu)良菌株，開發(fā)自主知識產權益生菌菌株和相關產品具有重要意義。益生菌在人體中發(fā)揮其益生功能得益于其優(yōu)良的抗消化道環(huán)境脅迫能力，對益生菌株的篩選要優(yōu)先考慮其克服胃液和膽鹽脅迫的能力[10]。本試驗通過對傳統(tǒng)泡菜中的40 株乳酸菌進行抗人工胃液、抗膽鹽能力研究，以期篩選出性能較好的菌株，為后續(xù)功能性開發(fā)、益生菌研究及應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

40株乳酸菌：從重慶市北碚區(qū)傳統(tǒng)泡菜中分離，保藏于西南大學食品科學學院；

MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂、瓊脂糖、胃蛋白酶1∶10 000、牛膽鹽：生化試劑，北京索萊寶科技有限公司；

巰基乙酸鈉、鹽酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

50×TAE工作液(Solarbio)、λDNA/Hind Ⅲ、2×Taq PCR MasterMixAgar、100 bp DNA Ladder、6×DNA Loading Buffer、細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

上游引物(正向引物)27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3)、下游引物(反向引物)1495R(5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 主要儀器設備

潔凈工作臺：SW-CJ-2F型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9160型，上海齊欣科學儀器有限公司；

生物顯微鏡：OLYMPUS-BX43型，日本奧林巴斯公司；

高速冷凍式離心機：5810型，德國Eppendorf公司；

紫外分光光度計：BioSpec-Mini型，日本島津公司；

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

梯度PCR 儀：S1000 Thermal Cycler型，美國Bio-Rad 公司；

小型水平電泳槽：Mini-Sub Cell GT型，美國Bio-Rad 公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Gene Genius型，英國SynGene 公司。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株 將-20 ℃、甘油保存的乳酸菌按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，得到第一代菌液，于MRS固體培養(yǎng)基中進行劃線培養(yǎng)，48 h后挑取單菌落進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，初步判斷各菌株是否為純種乳酸菌?；罨?次后的菌株放在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 初篩 取5 mL活化好的菌液3 000 r/min離心10 min，獲得菌株沉淀，用無菌生理鹽水洗滌2 次，再將菌泥重懸于5 mL 的無菌生理鹽水中，制成菌濁液。用1 mol/L HCl調節(jié)MRS液體培養(yǎng)基至pH 3.0，接種2%活化好的乳酸菌菌懸液，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，測其吸光值OD600 nm[11]，選擇在此條件下生長較好的菌株進行下一步試驗。

1.2.3 抗人工胃液試驗

(1) 人工胃液的配制：取一定量的蒸餾水，加入0.2%NaCl(質量濃度)、0.35%胃蛋白酶(質量濃度)，充分溶解后用1 mol/L的鹽酸調節(jié)溶液酸堿度至pH 3.0，再用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，所得無菌人工胃液需現(xiàn)配現(xiàn)用[12]。

(2) 取活化好的菌液5 mL，離心(3 000 r/min，10 min)獲得菌株沉淀，用無菌生理鹽水洗滌2 次，重懸于5 mL無菌生理鹽水中制成菌濁液。菌濁液與人工胃液按1∶9(體積比)混合，于37 ℃分別處理0，3 h，處理后用生理鹽水進行1∶10 倍稀釋，采用涂布平板法進行活菌記數(shù)(37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h)。每組做3次平行試驗，結果以“平均值±標準方差”來表示，按照式(1)計算菌株對人工胃液的耐受力[13]。

(1)

式中：

R——胃液中的存活率，%；

m1——處理3 h的活菌數(shù)，CFU/mL；

m2——處理0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4 膽鹽中生長效率的測定 選用在人工胃液中存活率大于50%的菌株進行該試驗，按2%的接種量取活化好的乳酸菌菌液分別接種于含0.0%，0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%，1.0%質量濃度的牛膽鹽MRS-THIO液體培養(yǎng)基中(MRS液體培養(yǎng)基加0.2%的巰基乙酸鈉)，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS-THIO液體培養(yǎng)基為對照，對上述不同質量濃度液體培養(yǎng)基的OD600 nm值進行測定。每組做3次平行試驗，結果以“平均值±標準方差”來表示，按照式(2)計算菌株對膽鹽的耐受力[13-14]。

(2)

式中：

R——生長效率，%；

A1——含膽鹽培養(yǎng)基OD600 nm；

A2——不含膽鹽培養(yǎng)基OD600 nm。

1.2.5 優(yōu)良乳酸菌16S rDNA 序列同源性分析 對人工胃液和膽鹽耐受能力較強的乳酸菌進行16S rDNA 序列同源性分析，按照細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書提取總DNA。25 μL PCR反應體系為：10 μmol/L引物(1495R和27F)各1 μL、DNA模版1 μL、2×Taq PCR Master mix 12.5 μL、無菌超純水9.5 μL。PCR反應程序[15]：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30 次循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR產物用1.5%～2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，再將PCR 產物送華大科技有限公司測序，測序結果用NCBI中的BLAST程序進行同源性比對分析。

1.2.6 構建系統(tǒng)發(fā)育樹 從GeneBank 中調取與所測乳酸菌16S rDNA序列較為相近的乳酸菌序列作為參考序列，用MEGA 6.0 軟件中的Neighbor-Joining 方法構建抗性菌株的同源序列系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

2 結果與分析

2.1 菌株活化

保藏于甘油(-20 ℃)中的乳酸菌，活化后結果見圖1，菌株在平板上的菌落形態(tài)單一，可初步判定菌株為純種。經革蘭氏染色，鏡檢后，其細胞呈紫色且形態(tài)均一，表明其為革蘭氏陽性菌且為純種。因此，活化后的菌株可用于后續(xù)試驗。

圖1 菌落形態(tài)與菌株鏡檢圖(MFR-38)

2.2 初篩試驗

以菌液吸光度值為初篩依據(jù)。吸光值OD600 nm<0.050的菌液，認定為不生長(-)，吸光值0.0500.110的菌液，認定為生長狀況良好(++)[17]。

由表1可知，在pH 3.0的耐酸試驗中，有23 株乳酸菌生長良好，7 株生長較差，其余10 株未生長。表明有30 株乳酸菌對酸性環(huán)境具有耐受性，因此選擇這些菌株進行人工胃液試驗。

2.3 人工胃液試驗

人體消化道是人體對抗外界病原微生物的生理屏障，通過消化道的食物中絕大多數(shù)微生物都會失活。益生菌要想發(fā)揮其益生功能，就必須具備通過胃腸道并存活的能力。胃酸是胃液中的主要成分，能通過改變細胞膜的通透性，致使細菌裂解死亡。乳酸菌耐酸機制主要包括雙組分信號轉導系統(tǒng)，胞內外pH平衡調節(jié)，細胞膜脂肪酸成分變化，受損蛋白質、DNA修復能力等[18]。除胃酸之外，胃蛋白酶等物質也具有抗菌性。通過測定益生菌在模擬胃液中的存活率來判斷其耐受能力，更符合實際意義。一般情況下，人體胃液pH常為3.0左右，食物通過胃的時間常為1～2 h，以人工胃液pH 3.0和作用時間3 h為篩選依據(jù)[13]。

表1 菌液吸光度值的測定結果?

? “++”為生長良好，“+”為生長較差，“-”為不生長。

由表2可知，不同乳酸菌在人工胃液中的存活率是不同的，30 株乳酸菌中除去12 株未能存活，其余18 株的存活率都分別介于0.08%～90.47%，其中存活率>50%的乳酸菌有MFR-1、MFR-2、MFR-9、MFR-13、MFR-17、MFR-21、MFR-28和MFR-30，而存活率>80%的乳酸菌就只有MFR-28和MFR-30。熊強等[19]通過對自制泡菜中分離篩選出的6株植物乳桿菌進行模擬胃液試驗，發(fā)現(xiàn)有4株菌的存活率在80%以上。Zielińska D等[20]研究泡菜黃瓜和白菜樣品中15 株乳酸菌的抗胃液能力，發(fā)現(xiàn)所有菌株存活率均在95%左右。趙芳等[21]從健康人腸道和奶豆腐中初篩出8株乳酸菌，進行人工胃液試驗，發(fā)現(xiàn)其存活率均低于15%，需進一步通過馴化提高其抗胃液能力。與之相比，自傳統(tǒng)泡菜中分離篩選出的MFR-28和MFR-30在模擬胃液中的存活率均高于80%，分別為85.21% 和90.47%，具備較高的抗性。

表2 菌株對人工胃液耐受能力的測定結果

2.4 不同膽鹽濃度下乳酸菌的生長效率

膽鹽是由肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y合而形成的鈉鹽或鉀鹽，具有殺菌作用，在十二指腸中的質量濃度一般為0.03%～0.3%?？鼓扄}能力是腸道微生物定值和發(fā)揮代謝活性的先決條件，能作為篩選益生菌的重要特征。研究表明乳酸菌耐膽鹽機制主要與膽鹽水解酶、表層蛋白、自身細胞膜等有關[18]。采用膽鹽生長效率來評價菌株耐膽鹽能力，與測定膽鹽存活率和膽鹽生長遲滯期等試驗相比，更簡便省時。本試驗設計了0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.50%，1.00% 6個膽鹽濃度。

由表3可知，8 株乳酸菌在高膽鹽濃度下，生長效率均受到抑制，可能是高鹽環(huán)境至乳酸菌破裂死亡。陳孝勇等[13]從傳統(tǒng)發(fā)酵牛乳中分離篩選出6株優(yōu)良乳酸菌，其在0.3%膽鹽中的生長效率均在20%～35%。南曉芳[22]從豆豉和腐乳樣品中篩選出5株耐鹽乳酸菌，其在0.3%膽鹽中的生長效率均為10%～15%。相比之下，自泡菜中篩選出的菌株MFR-28和MFR-30具備一定的抗膽鹽能力，在0.3%膽鹽中的生長效率分別為11.84%和7.37%，說明2株菌種可以在該濃度膽鹽條件下緩慢生長，可以作為潛在益生菌。為更準確地評價這2株菌的特性，還需進一步進行動物試驗。

表3 菌株在膽鹽中生長效率的測定結果

2.5 潛在益生菌株16S rDNA 的PCR擴增

經上述體外篩選試驗，綜合得出抗人工胃液和抗膽鹽能力較強的菌株為MFR-28和MFR-30，并對其進行16S rDNA 序列同源性分析。由圖2可知，PCR擴增產物在1 500 bp Marker 條帶附件出現(xiàn)一條明亮的條帶而無拖尾現(xiàn)象，陰性對照未見條帶，說明PCR擴增成功，與預期效果相同。

16S rDNA序列分析可以確定微生物菌種之間的親緣關系。當菌株之間的16S rDNA序列同源性高于97.5%時，認為它們?yōu)橥N。由表4可知，MFR-28號和MFR-30號乳酸菌均為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)且同源性都為100%。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖3可知，MFR-28和MFR-30與干酪乳桿菌都聚在同一個分支上，同源性為100%，由此可判斷出MFR-28和MFR-30均為干酪乳桿菌，乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果與16S rDNA序列同源性分析結果是一致的。

M. 100 bp DNA Ladder 0. 陰性對照 1. MFR-28 2. MFR-30

Figure 2 Gel electrophoresis map of PCR amplification products of probiotics 16S rDNA

表4 抗性菌株的鑒定結果

圖3 基于抗性菌株16S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論

在40 株分離自傳統(tǒng)泡菜的乳酸菌中篩選出2 株，分別為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)MFR-28和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)MFR-30，其對胃液和膽鹽均具有良好的抗受性，在pH 3.0人工胃液中存活率分別為85.21%和90.47%，在0.3%的膽鹽中生長效率分別為11.84%和7.37%?？勺鳛闈撛谝嫔M一步對其進行功能評價，為研發(fā)益生菌制品提供了依據(jù)。

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Screening and identification of resistant lactobacillus in traditional pickles

LIUSi-yu1,2,3

XIAOJing1,2,3

SUOHua-yi1,2,3

(1.CollegeofFoodScienceinSouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.NationalDemonstrationCenterforExperimentalFoodScienceandTechnologyEducation,Chongqing400715,China; 3.ChongqingEngineeringResearchCenterofRegionalFood,Chongqing400715,China)

40 strains of actic acid bacteria isolated by traditional pickled cabbage were regarded as the object. Through the tests of acid resistance, anti gastric juice and bile salt resistance, actic acid bacteria with good resistance in traditional pickles were determined, using 16S rDNA sequence and phylogenetic tree to analyze the genus relationship of good resistance of lactic acid bacteria. The experimental results showed that MFR-28 and MFR-30 facing to artificial gastric juice and bile salt had a strong tolerance in 40 strains of actic acid bacteria, and survival rates in the artificial gastric juice were 85.21% and 90.47% respectively, and the growth of efficiency in 0.3% bile salt were 11.84% and 7.37% respectively; through the analysis of 16S rDNA sequence and phylogenetic tree, MFR-28 and MFR-30 wereLactobacilluscasei. In this study, 2 strains of resistantlactobacilluscaseican be used as potential probiotics to further explore their physiological functions and to develop probiotic products.

pickles;lactobacillus; tolerance; artificial gastric juice; bile salt

劉思雨，女，西南大學在讀本科生。

索化夷(1978—)，男，西南大學副教授，碩士生導師，博士。E-mail：birget@swu.edu.cn

2017—05—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.006