周 慧， 周偉強

(沈陽醫(yī)學院 1. 組織學與胚胎學教研室、2. 病原生物學教研室，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034)

組蛋白去乙酰化酶抑制劑調控p21WAF1/CIP1啟動子乙?；接绊懭橄侔㎝CF-7細胞周期

周 慧1， 周偉強2

(沈陽醫(yī)學院 1. 組織學與胚胎學教研室、2. 病原生物學教研室，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034)

目的研究組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)調控p21WAF1/CIP1啟動子乙?；剑{節(jié)乳腺癌MCF-7細胞周期的分子機制。方法采用實時定量PCR、Western blot和DNA-ChIP方法測定SAHA對乳腺癌MCF-7細胞周期調控系統(tǒng)的影響；應用染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)技術探究SAHA調控p21WAF1/CIP1啟動子乙?；降那闆r。結果SAHA明顯影響乳腺癌細胞周期相關調控因子的表達；在針對p21WAF1/CIP1基因功能的篩查中發(fā)現(xiàn)，SAHA可明顯誘導p21WAF1/CIP1mRNA和蛋白的表達，并且可調節(jié)p21WAF1/CIP1啟動子乙?；?。結論SAHA通過影響p21WAF1/CIP1啟動子乙酰化程度調節(jié)乳腺癌MCF-7細胞周期的進程。

乳腺癌；雌激素受體陽性細胞；MCF-7；SAHA；p21WAF1/CIP1；乙?；?/p>

乳腺癌是乳腺上皮組織細胞發(fā)生癌變所形成的，近年來其發(fā)病率逐年上升，并有年輕化的趨勢[1]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展與雌激素受體(estrogen receptor, ER)表達密切相關。雌激素信號經(jīng)ER介導，刺激癌基因的表達，抑制抑癌基因的功能，引起癌變。臨床上大多數(shù)乳腺癌患者為ER陽性，約占總發(fā)病率的70%以上。但是ER在乳腺癌中的作用機制還不是很明確，通過對ER的研究，闡明其在乳腺癌中的發(fā)病機制，并探究其在預防及治療乳腺癌中的意義都十分重要[2-3]。

p21WAF1/CIP1屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)家族，定位于6p21.2染色體，基因全長8.6 kb，編碼164個氨基酸殘基組成的蛋白質。p21WAF1/CIP1可以促使細胞周期停滯、促進細胞凋亡并抑制癌細胞的轉移和侵襲[4]。

大量研究表明，組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)的異常可引發(fā)乳腺癌。而通過抑制HDAC的功能可以起到治療腫瘤的目的[5-6]。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)為一種廣譜HDAC抑制劑，近年來的研究證明其可抑制乳腺癌細胞增殖并引起細胞凋亡[7]。本文以乳腺癌ER陽性細胞系MCF-7為研究對象，探討SAHA對ER陽性乳腺癌細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室凍存；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素，購自美國Thermo公司；SAHA、人重組Leptin蛋白，購自美國Sigma-Aldrich公司；EZ ChIP 試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；HRP偶聯(lián)多克隆抗體、抗β-actin抗體，購自美國Abcam公司；抗HDAC1單克隆抗體、抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體、抗組蛋白H4多克隆抗體、抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體、抗組蛋白H3多克隆抗體等購自美國Millipore 公司；其他化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2.2全細胞RNA提取和實時定量PCR 將5×108·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于6孔板各孔中，細胞無血清同步化處理后，加入0.625 nmol·L-1Leptin和10 μmol·L-1SAHA與MCF-7細胞孵育24 h。Rneasy mini kit提取全細胞RNA，第一條鏈cDNA合成后，應用SYBR Green方法，以GAPDH為內(nèi)參進行實時定量PCR反應。25 μL反應體系中包含1×SYBR Green Supermix試劑12.5 μL, 0.1 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA(10 ng)和9.5 μL雙蒸水。實時定量PCR擴增參數(shù)為：50℃ 2 min，95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃延伸1 min，延伸后檢測熒光信號，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔，mRNA相對表達量按照2-△△Ct法計算。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Prime sequence of real-time PCR

1.2.3Western blot檢測 上述Leptin和SAHA處理后的MCF-7細胞經(jīng)胰蛋白酶消化、離心后，取細胞團塊經(jīng)M-PER裂解液裂解，應用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg各樣品組蛋白進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜后，加入1 ∶1 000稀釋的羊抗HDAC1單克隆抗體、羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體、羊抗組蛋白H3多克隆抗體、羊抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體、羊抗組蛋白H4多克隆抗體和羊抗p21WAF1/CIP1多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，以羊抗β-actin多克隆抗體作對照。加入1 ∶5 000包被HRP的兔抗羊多克隆抗體，室溫孵育1 h后，化學發(fā)光法測定蛋白含量。

1.2.4DNA-ChIP 將6×109·L-1的乳腺癌MCF-7細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，血清饑餓同步化處理后，加入0.625 nmol·L-1Leptin和10 μmol·L-1SAHA共同培養(yǎng)24 h(培養(yǎng)方法與孵育時間同“1.2.2”)。經(jīng)預冷PBS沖洗2次后，1 %戊二醛室溫振蕩固定10 min。1×甘氨酸室溫中和5 min后，預冷PBS沖洗2次。用細胞鏟刮掉培養(yǎng)皿中細胞，700×g離心5 min后，用含Micrococcal nuclease (10 unit·μL-1)的細胞裂解液溶解細胞。離心后，取上清液，分別與羊抗乙?；M蛋白H3多克隆抗體和羊抗乙?；M蛋白H4多克隆抗體4℃孵育過夜。加入Protein G Agarose和細胞IP孵育液4℃振蕩作用1 h，5 000×g離心1 min，取Protein G Agarose細胞IP復合物，依次經(jīng)低鹽、高鹽、LiCl、TE溶液沖洗后，經(jīng)Elution Buffer洗脫、5 mol·L-1NaCl 65℃去交聯(lián)、DNA柱純化后，所得沉淀即為ChIP 產(chǎn)物。加入2.5 μL ChIP 產(chǎn)物進行實時定量PCR分析，以GAPDH基因啟動子片段為內(nèi)參。

2 結果

2.1SAHA通過調控乳腺癌細胞周期調控系統(tǒng)因子的表達而影響乳腺癌細胞生長Fig 1結果顯示，將SAHA與乳腺癌MCF-7細胞作用后發(fā)現(xiàn)，SAHA明顯抑制了乳腺癌細胞CDK2、CyclinE1、CDK4、CyclinD1 mRNA和蛋白的表達。經(jīng)SAHA作用后，CDK2、CyclinE1、CDK4、CyclinD1都有不同程度的下降，而Leptin處理后，這些因子的表達都明顯上升。另外，我們發(fā)現(xiàn)，凋亡調控因子Bcl-2的表達也發(fā)生了變化，SAHA抑制了其mRNA和蛋白的表達，而Leptin則誘導了其表達。

Fig 1 Effects of SAHA on expressions ofcell cycle regulators in MCF-7 breast cancer cells

A: Quantitative real-time PCR；B: Western blot. B: Basal；B+S: Basal+SAHA；L: Leptin；L+S: Leptin+SAHA.*P<0.05vsbasal

2.2SAHA影響MCF-7細胞乙?；絊AHA作用MCF-7細胞后對乙?；降挠绊懀Y果見Fig 2，SAHA可抑制HDAC1 mRNA和蛋白的表達。而乙?；M蛋白H3和H4的蛋白表達量在SAHA的作用下大幅上升，而作為細胞生長因子的Leptin則有相反的作用效果。DNA-CIhP實驗證實了SAHA作用后，MCF-7細胞內(nèi)與乙?；疕3和H4抗體結合的DNA物質大幅升高，而Leptin作用后，與乙?；疕3和H4抗體結合的DNA量明顯減少。

2.3SAHA影響乳腺癌細胞增殖過程中伴隨著p21WAF/CIP1啟動子功能的上升Fig 3結果表明，SAHA處理的乳腺癌MCF-7細胞中p21WAF/CIP1mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組細胞，而Leptin則抑制了p21WAF/CIP1的功能(Fig 2A、2B)。DNA-ChIP結果顯示，SAHA作用MCF-7細胞后，p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域與乙?；M蛋白H3、H4結合的染色質物質明顯多于未處理細胞組，而同樣Leptin處理后p21WAF/CIP1啟動子區(qū)域結合的DNA量明顯減少(Fig 2C、2D)。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率上升趨勢明顯。p21WAF1/CIP1是具有廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白，與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉移有關。HDAC 的過度表達可使核心組蛋白高度去乙?；?，進而染色體發(fā)生凝聚，使相關基因轉錄受到抑制，引起癌變的發(fā)生[8-9]。HDAC抑制劑因此被視為一類有廣闊應用前景的抗癌藥物[10-12]。SAHA作為組蛋白去乙?；敢种苿?，具有良好的抗腫瘤作用。在本研究中，我們應用SAHA與乳腺癌MCF-7細胞作用，發(fā)現(xiàn)SAHA明顯抑制了乳腺癌細胞周期相關調控因子的表達，其主要對G1-S期進程進行調控，因此SAHA可能通過抑制細胞周期S期進程而發(fā)揮調控作用。另外，針對p21WAF1/CIP1基因功能的篩查中發(fā)現(xiàn)，SAHA可明顯誘導p21WAF1/CIP1mRNA和蛋白的表達，并且可調節(jié)p21WAF1/CIP1啟動子的功能。綜上所述，本文明確了SAHA通過調控p21WAF1/CIP1啟動子乙酰化水平，影響乳腺癌MCF-7細胞周期。

Fig 2 Effects of SAHA on acetylated levels in MCF-7 breast cancer cells

A：Determination of HDAC1 by quantitative real-time PCR；B: Western blot；C: Determination of acetylated histone H3 by ChIP；D: Determination of acetylated histone H4 by ChIP. B: Basal；B+S: Basal+SAHA；L: Leptin；L+S: Leptin+SAHA.*P<0.05vsbasal

Fig 3 SAHA functions on specific regions ofp21WAF/CIP1 to inhibit HDAC1 expressions

A: Quantitative real-time PCR；B: Western blot；C: ChIP for AcH3；D: ChIP for AcH4. B: Basal；B+S: Basal+SAHA；L: Leptin；L+S: Leptin+SAHA.*P<0.05vsbasal

(致謝：衷心感謝沈陽醫(yī)學院遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室為本實驗提供的實驗設備，感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協(xié)助。)

[1] Parbin S, Shilpi A, Kar S, et al. Insights into the molecular interactions of thymoquinone with histone deacetylase: evaluation of the therapeutic intervention potential against breast cancer[J].MolBiosyst, 2016,12(1):48-58.

[2] Mawatari T, Ninomiya I, Inokuchi M, et al. Valproic acid inhibits proliferation of HER2-expressing Breast cancer cells by inducing cell cycle arrest and apoptosis through Hsp70 acetylation[J].IntJOncol, 2015,47(6):2073-81.

[3] Clocchiatti A, Di Giorgio E, Viviani G, et al. The MEF2-HDAC axis controls proliferation of mammary epithelial cells and acini formationinvitro[J].JCellSci, 2015,128(21):3961-76.

[4] 鄒 丹, 周偉強. 乳腺癌MCF- 7細胞p21WAF1/CIP1啟動子區(qū)HDAC1高功能結合位點的研究[J]. 中國藥理學通報, 2017,33(3): 317-21.

[4] Zou D, Zhou W Q. A study on high function binding site of HDAC1 in p21WAF1/CIP1promoter region in breast cancer MCF- 7 cells [J].ChinPharmacolBull, 2017,33(3): 317-21.

[5] Raha P, Thomas S, Thurn K T, et al. Combined histone deacetylase inhibition and tamoxifen induces apoptosis in tamoxifen-resistantbreast cancer models, by reversing Bcl-2 overexpression[J].BreastCancerRes, 2015,17(1):26-42.

[6] Wang L, Chen G, Chen K, et al. Dual targeting of retinoid X receptor and histone deacetylase with DW22 as a novel antitumor approach[J].Oncotarget, 2015,6(12):9740-55.

[7] Ma J, Guo X, Zhang S, et al. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, suppresses proliferation and promotes apoptosis of esophageal squamous cell lines[J].MolMedRep, 2015,11(6):4525-31.

[8] Ji Z, Su J, Liu C, et al. Integrating genomics and proteomics data to predict drug effects using binary linear programming[J].PLoSOne, 2014,9(7):e102798.

[9] Speirs V, Adams I P, Walton D S, et al. Identification of wild-type and exon 5 deletion variants of estrogen receptor beta in normal human mammary gland[J].JClinEndocrinolMetab, 2000,85(4):1601-5.

[10] Speirs V, Carder P J, Lane S, et al. Estrogen receptor β what is means for patients with breast cancer[J].LancetOncol, 2004,5(3):174-81.

[11] Murphy L C, Watson P H. Is estrogen receptor-beta a predictor of endocrine therapy responsiveness in human breast cancer [J]?EndocrRelatCancer, 2006,13(2):327-34.

[12] 龔愛華, 熊二夢, 張 嚴, 等. SAHA誘導的p21表達致U251MG細胞抗凋亡效應[J]. 中國藥理學通報, 2013,29(12):1743-7.

[12] Gong A H, Xiong E M, Zhang Y, et al. SAHA-induced p21 expression results in anti-apoptotic effects in U251MG cells [J].ChinPharmacolBull, 2013,29(12):1743-7.

SAHAaffectscellcycleofMCF-7breastcancercellsbyregulatingacetylatedlevelsofp21WAF1/CIP1promoter

ZHOU Hui1, ZHOU Wei-qiang2

(1.DeptofHistologyandEmbryology; 2.DeptofPathogenBiology,KeyLabofEnvironmentalPollutionandMicroecologyofLiaoningProvince,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China)

AimTo study the regulation mechanisms of deacetylase inhibitor SAHA in p21WAF1/CIP1promoter acetylation in breast cancer MCF-7 cells.MethodsWe used quantitative real-time PCR, Western blot and DNA-ChIP to determine the effects on the regulation of cell cycle with SAHA treatment in MCF-7 cells. By DNA-ChIP, we assessed the acetylation level of p21WAF1/CIP1promoter.ResultsSAHA significantly affected the expression of cell cycle-related factors, and induced the mRNA and protein expression of p21WAF1/CIP1. SAHA could adjust the acetylation level of p21WAF1/CIP1promoter.ConclusionSAHA regulates the cell cycle progression by adjusting the acetylation level of p21WAF1/CIP1promoter in MCF-7 cells.

breast cancer; estrogen receptor positive cell line; MCF-7; SAHA; p21WAF1/CIP1; acetylation

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.018

A

：1001-1978(2017)10-1421-05

R329.24；R329.28；R737.902.2；R977.3

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.036.html

2017-05-10,

2017-07-20

國家自然科學基金資助項目(No 81172509)

周 慧(1982-)，女，博士，講師，研究方向：腫瘤學，E-mail：zhouhui8013@163.com； 周偉強(1970-)，男，博士，教授，研究方向：乳腺癌發(fā)生與調控，通訊作者，E-mail：zhouwq@hotmail.com