富瑩雪，陳玉萍，卞文青，許惠琴，戴國英，沈紅勝，甘嘯陽，王 威

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

梓醇對AGEs刺激腎系膜細(xì)胞介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的影響

富瑩雪1,2，陳玉萍1,2，卞文青1,2，許惠琴1,2，戴國英1,2，沈紅勝1,2，甘嘯陽1,2，王 威1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

目的探討梓醇對晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)刺激腎系膜細(xì)胞介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的影響。方法將巨噬細(xì)胞(RAW264.7)置于Transwell上層小室，腎系膜細(xì)胞(MMCs)于下層孔板進行體外共培養(yǎng)，設(shè)置模型組、0-BSA對照組、梓醇組(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)，另設(shè)氨基胍組(1.0 μmol·L-1)作為陽性對照。加入各藥物預(yù)孵下層系膜細(xì)胞1 h后，用AGEs(100 mg·L-1)刺激，繼續(xù)孵育23 h，采用ELISA法檢測系膜細(xì)胞上清液中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的分泌水平； Western blot法檢測巨噬細(xì)胞 M1 型標(biāo)記蛋白iNOS、CD16/32、TNF-α、COX-2和M2 型標(biāo)記蛋白CD206、Arg-1的表達水平；流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞iNOS與CD206蛋白表達百分率。結(jié)果AGEs可提高系膜細(xì)胞MCP-1的分泌水平(P<0.01)，上調(diào)巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2蛋白表達(P<0.05,P<0.01)，下調(diào)CD206和Arg-1蛋白表達；而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)預(yù)孵能降低系膜細(xì)胞MCP-1的分泌水平(P<0.01)，下調(diào)iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2蛋白表達(P<0.05,P<0.01)，上調(diào)CD206和Arg-1蛋白表達(P<0.05)，并呈濃度依賴性。結(jié)論梓醇可通過調(diào)控AGEs刺激系膜細(xì)胞分泌MCP-1的水平，抑制巨噬細(xì)胞的M1型極化，并促進其向 M2 型極化，減輕炎癥反應(yīng)，緩解糖尿病腎損傷。

梓醇；晚期糖基化產(chǎn)物；系膜細(xì)胞；單核趨化蛋白-1；巨噬細(xì)胞；極化；糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常見且最難治的微血管并發(fā)癥，其特征主要表現(xiàn)為炎癥、系膜基質(zhì)累積以及腎小管間質(zhì)纖維化[1]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)在DN的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[2-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AGEs還可加重DN炎性損傷[5-7]。巨噬細(xì)胞作為主要的炎性細(xì)胞，通過其兩種極化表型參與炎癥反應(yīng)及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)：即經(jīng)典活化的 M1型巨噬細(xì)胞，具有促進炎癥、介導(dǎo)損傷的功能；替代活化的M2型巨噬細(xì)胞，具有抑制炎癥、促進損傷組織修復(fù)和重建的功能[8-9]。越來越多的證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞和腎臟固有細(xì)胞共同參與DN的發(fā)展[10-16]。腎臟固有細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-Ⅰ)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule Ⅰ, ICAM-1)等，使巨噬細(xì)胞向M1型極化[9,16]，參與炎癥反應(yīng)，加重糖尿病腎損傷[9-11,17]。

梓醇是生地黃的主要效應(yīng)成分，具有較好的抗炎和保護腎臟等藥理作用[18]。研究證實，梓醇能減少巨噬細(xì)胞募集，抑制炎癥反應(yīng)[19]，并可抑制腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)和血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的表達，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，改善DN[20]。鑒于以上認(rèn)識，本實驗從DN病機出發(fā)，建立用AGEs刺激的系膜細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察和探討梓醇對巨噬細(xì)胞極化的干預(yù)作用，為其減輕由巨噬細(xì)胞參與的糖尿病腎損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞與試劑小鼠腎系膜細(xì)胞(mouse mesangial cells, MMCs)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)實驗室惠贈。梓醇(catalpol)標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，購自成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Z-005-160502；氨基胍(aminoguanidine)，Sigma公司進口分裝；DMEM/F-12 1 ∶1(1×)培養(yǎng)液、質(zhì)量濃度為1.5 g·L-1的胰蛋白酶，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Gemini公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，美國Sigma公司；RIPA裂解液，碧云天生物技術(shù)研究所；MCP-1 ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：201703；iNOS、TNF-α、COX-2、CD206、Arg-1抗體，英國Abcam公司；CD16/32抗體，美國Affinity公司。

1.2儀器Synergy HT酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司；垂直凝膠電泳儀，美國伯樂公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國GE公司；Transwell 3450、3413共培養(yǎng)板，美國Corning公司。

2 方法

2.1AGEs的制備將 0.5 mol·L-1葡萄糖與 50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)充分溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)，37℃避光孵育4個月，形成 AGEs-BSA。與此同時，在平行條件下配制不含葡萄糖的上述 BSA 溶液，使其形成 0-BSA 溶液(無糖基化BSA)作為對照。AGEs 形成后，用孔徑為分子量1萬的透析袋于10 mmol·L-1PBS緩沖液中4℃透析24 h，除去未反應(yīng)的葡萄糖，后經(jīng)0.22 μm微孔濾器過濾，除去細(xì)菌，經(jīng)BCA蛋白定量測得濃度為16 g·L-1。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)小鼠腎系膜細(xì)胞(MMCs)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)用含1 g·L-1胎牛血清及0.1 g·L-1青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.3ELISA法檢測系膜細(xì)胞上清液MCP-1的分泌取對數(shù)生長期MMCs調(diào)整至1×108·L-1，每孔1 mL接種于24孔板內(nèi)，另取對數(shù)生長期RAW264.7以5×107·L-1，每孔0.5 mL接種于0.4 μm的Transwell小室，置于孵育箱中貼壁融合后，24孔板和Transwell 小室分別更換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為模型組、梓醇(終濃度分別為0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)組、氨基胍(終濃度為1 μmol·L-1)組，每組設(shè)4個復(fù)孔，預(yù)孵24孔板內(nèi)的MMCs 1 h后，用終濃度為100 mg·L-1的AGEs刺激，而空白對照組用100 mg·L-1BSA代替，最后將Transwell小室移至接種MMCs的24孔板上方共培養(yǎng)。23 h后，提取下層6孔板內(nèi)MMCs上清液，按ELISA試劑盒操作說明書，檢測細(xì)胞上清中MCP-1水平。

2.4流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞蛋白表達百分率取對數(shù)生長期MMCs調(diào)整至5×108·L-1，每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)，另取對數(shù)生長期RAW264.7以3×108·L-1，每孔1 mL接種于0.4 μm的transwell 小室。分組與加藥處理同“2.3”項，去除上層小室內(nèi)培養(yǎng)液，用冰PBS沖洗3次RAW264.7，并吹打混懸于小室中，離心收集細(xì)胞，重懸在100 μL 1×Buffer緩沖液中，每管加1 μL一抗，在同型對照管中加入100 μL緩沖液，4℃冰箱中孵育20 min，每管中加2 mL 1×Buffer緩沖液，4℃ 300 r·min-1離心5 min，并棄去上清。用冰PBS沖洗3次，將細(xì)胞重懸在100 μL 1×Buffer 緩沖液中，加入0.8 μL熒光標(biāo)記二抗，4℃冰箱中避光孵育20 min。用冰PBS沖洗3次后，移至流式測試管，500 μL 緩沖液重懸細(xì)胞，上機檢測巨噬細(xì)胞中表達iNOS、CD206蛋白的百分率。

2.5Westernblot法檢測巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白表達取對數(shù)生長期MMCs調(diào)整至2×108·L-1，每孔2 mL接種于6孔板內(nèi)，另取對數(shù)生長期RAW264.7以1×108·L-1，每孔1 mL接種于0.4 μm的transwell 小室。分組與加藥處理同“2.3”項。每組設(shè)3個復(fù)孔，吸除上層小室內(nèi)培養(yǎng)液，用冰PBS沖洗RAW264.7并吹打混懸于小室中，離心收集細(xì)胞，用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白樣品加入1/5體積的5×蛋白上樣緩沖液，95℃煮5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，接著轉(zhuǎn)印至 PVDF膜上，按約0.1 mL·cm-1量加入0.5 g·L-1封閉液，室溫封閉2 h，一抗4℃過夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL顯色。利用Image J軟件分析各組灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2、CD206和Arg-1蛋白的變化。

3 結(jié)果

3.1梓醇對系膜細(xì)胞分泌MCP-1的影響與對照組比較，AGEs可明顯提高系膜細(xì)胞MCP-1的分泌水平(P<0.01)；而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度抑制其分泌(P<0.01)，且梓醇的抑制程度與濃度相關(guān)(Tab 1)。

Tab 1 Effect of catalpol on level of MCP-1in MMCs induced by AGEs(±s，n=4)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.2流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果雙變量流式細(xì)胞散點圖顯示，與對照組(Fig 1A、2A)相比，模型組(100 mg·L-1AGEs)表達iNOS蛋白的巨噬細(xì)胞比例升高(Fig 1B)，表達CD206蛋白的巨噬細(xì)胞比例降低(Fig 2B)；而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)和氨基胍(1 μmol·L-1)則不同程度下調(diào)iNOS的表達(Fig 1C～1F)，上調(diào)CD206的表達(Fig 2C～2F)。

Fig 1 Effect of catalpol on expression of F4/80-iNOS inRAW264.7 macrophages mediated by AGEs-stimulated MMCs

A: Control(100 mg·L-10-BSA); B: Model(100mg·L-1AGEs); C: Catalpol(0.1 mol·L-1+AGEs);D:Catalpol(1.0 mol·L-1+AGEs);E:Catalpol(10.0 mol·L-1+AGEs);F:Aminoguanidine(1.0 mol·L-1+AGEs)

3.3梓醇對巨噬細(xì)胞M1型極化相關(guān)蛋白的影響與對照組比較，AGEs可明顯上調(diào)系膜細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS(Fig 3)、CD16/32(Fig 4)、TNF-α(Fig 5)、COX-2(Fig 6)蛋白表達(P<0.05,P<0.01)，而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度下調(diào)其表達(P<0.05,P<0.01)，且梓醇的抑制程度與濃度相關(guān)，其中10.0 μmol·L-1的梓醇抑制作用最強(P<0.05,P<0.01)。

3.4梓醇對巨噬細(xì)胞M2型極化相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較，AGEs可明顯下調(diào)系膜細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CD206(Fig 7)和Arg-1(Fig 8)蛋白表達(P<0.05)；而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度上調(diào)其表達(P<0.05)，且梓醇對CD206、Arg-1表達的促進作用與濃度相關(guān)。

Fig 2 Effect of catalpol on expression of F4/80-CD206in RAW264.7 macrophages mediated by AGEs-stimulated MMCs

A: Control(100 mg·L-10-BSA); B: Model(100 mg·L-1AGEs); C: Catalpol(0.1 mol·L-1+AGEs); D: Catalpol(1.0 mol·L-1+AGEs); E: Catalpol(10.0 mol·L-1+AGEs); F:Aminoguanidine(1.0 mol·L-1+AGEs)

4 討論

DN是一種常見的繼發(fā)性腎病，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是DN發(fā)展的關(guān)鍵因素[21]。趨化因子MCP-1是腎臟炎癥與腎損傷的主要啟動子[22]。研究報道[16]，AGEs可作用于腎臟固有細(xì)胞上的RAGE受體，促使MCP-1分泌，進而誘導(dǎo)、激活巨噬細(xì)胞。活化的巨噬細(xì)胞進一步分泌和釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)等[5,9,23]，參與炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致系膜增生，足細(xì)胞完整性改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞泡沫化，最終引起腎小球硬化等腎損傷[10,12-14]。因此，腎臟固有細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及各種炎癥分子交互調(diào)控，形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，值得人們關(guān)注。

Fig 3 Effect of catalpol on expressionof iNOS in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s, n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 4 Effect of catalpol on expressionof CD16/32 in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

隨著對巨噬細(xì)胞的深入研究，認(rèn)為它不僅介導(dǎo)腎組織炎性損傷，同時還參與腎組織損傷后的修復(fù)與重建[24-25]。在腎臟早期炎癥階段，巨噬細(xì)胞高表達iNOS和CD16/32(FcγRIII/II)，呈M1表型，而在腎組織修復(fù)階段，巨噬細(xì)胞高表達精氨酸-1(arginine-1, Arg-1)和甘露醇受體(mannose receptor, MR)，呈M2表型[15]。另有研究表明[25]，小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后10 d解除梗阻，腎臟纖維化程度的減輕與巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)記物CD206(MR)相關(guān)。因而，巨噬細(xì)胞的不同活化狀態(tài)決定腎臟疾病的發(fā)展方向[12-15]。

Fig 5 Effect of catalpol on expression ofTNF-α in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig 6 Effect of catalpol on expressionof COX-2 in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

本實驗構(gòu)建了腎系膜細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，經(jīng)AGEs刺激腎系膜細(xì)胞后，其MCP-1分泌水平提高，同時伴隨巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)記蛋白iNOS、TNF-α、CD16/32的表達水平提高，M2型標(biāo)記蛋白CD206和Arg-1的表達水平降低，而使用梓醇預(yù)孵再經(jīng)AGEs刺激可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，提示梓醇可能通過減少系膜細(xì)胞分泌MCP-1，抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，促使其向M2型極化，但具體機制有待進一步深入研究。

Fig 7 Effect of catalpol on expressionof CD206 in RAW264.7 macrophagesmediated by AGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig 8 Effect of catalpol on expressionof Arg-1 in RAW264.7 macrophages mediatedby AGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

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EffectofcatalpolonRAW264.7macrophagepolarizationmediatedbyAGEs-stimulatedmousemesangialcells

FU Ying-xue1,2, CHEN Yu-ping1,2, BIAN Wen-qing1,2, XU Hui-qin1,2,DAI Guo-ying1,2, SHEN Hong-sheng1,2, GAN Xiao-yang1,2, WANG Wei1,2

(1.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.JiangsuKeyLabforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,Nanjing210023,China)

AimTo investigate the effect that catalpol intervenes macrophage polarization mediated by mouse mesangial cells(MMCs) stimulated by advanced glycation end products(AGEs).MethodsRAW264.7 macrophages and MMCs were co-cultured in vitro and divided into model group(100 mg·L-1AGEs), control group(100 mg·L-1BSA), catalpol(0.1, 1.0, 10.0 μmol·L-1) group, and aminoguanidine(1.0 μmol·L-1) group which was set as positive control. After being incubated with catalpol for 1 h, MMCs were stimulated by AGEs for 23 h. The proliferation-inhibition rate of MMCs was measured by MTT assay. MCP-1 in supernatant liquid of MMCs was detected by ELISA method. The expression of iNOS, CD16/32, TNF-α, COX-2, CD206 and Arg-1 was detected by Western blot. Simultaneously, the percentage of iNOS and CD206 was also measured by flow cytometry.ResultsAGEs could increase the level of MCP-1 secreted by MMCs. The expression of iNOS, TNF-α, CD16/32 and COX-2 protein of macrophage was up-regulated after MMCs stimulated by AGEs, while the expression of CD206 and Arg-1 was down-regulated. After being intervened by catalpol, these effects could be reversed. All the changes were concentration-related.ConclusionsCatalpol can inhibit macrophages M1-type polarization process and promote M2-type polarization, which may be mediated through MCP-1 secreted by MMCs after AGEs stimulation. Catalpol can ameliorate inflammation and relieve diabetic kidney injury.

catalpol; advanced glycosylation products; mesangial cells; monocyte chemotactic protein-1; macrophage; polarization; diabetic nephropathy

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.014

A

：1001-1978(2017)10-1399-05

R-332；R284.1；R322.61；R329.24；R587.2；R692.39；R977.6

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.028.html

2017-06-01,

2017-07-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81374029, 81073111)；江蘇省中藥學(xué)優(yōu)勢學(xué)科開放課題(No JKLPSE201604)

富瑩雪(1993-)，女，碩士生，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)，E-mail: 449743578@163.com； 許惠琴(1961-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：hqxu309@sina.com