江偉 王鵬 左威 程超 曾文 張亮 李維新

SHP-2激活突變對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及增殖影響的研究

江偉 王鵬 左威 程超 曾文 張亮 李維新

目的探討含同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SHP-2）激活突變對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及增殖活性的影響，為抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)變尋找新的靶點(diǎn)。方法設(shè)計(jì)載有pcDNA3.1 SHP-2D61Gmutant激活突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U521膠質(zhì)瘤細(xì)胞，將穩(wěn)定表達(dá)SHP-2的細(xì)胞作為為突變組，設(shè)置不含激活突變基因的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空載組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為正常對照組。在相同條件下對3組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測定各組細(xì)胞增殖活性，侵襲能力以及細(xì)胞凋亡情況，評價腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及增殖活性。采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，組間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果培養(yǎng)24 h后突變組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖速度及活力相較于對照組和空載組均顯著升高（t= 13.236，16.782，P均＜0.01）；突變細(xì)胞侵襲能力（431.25±4.98）相較于對照組（66.05 ± 5.13）和空載組（67.11±5.25）均明顯升高（t= 22.343，26.112，P均＜0.01），細(xì)胞凋亡率（8.23﹪）相較于對照組（33.76﹪）和空載組（26.77﹪）也均顯著降低（t= 32.267，22.982，P均＜ 0.01）。結(jié)論SHP-2激活突變可提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速度、侵襲能力和細(xì)胞活力，發(fā)生惡性生物學(xué)行為改變，可能成為抗腫瘤惡性轉(zhuǎn)變的新靶點(diǎn)。

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶類； 突變； 神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞增殖

膠質(zhì)細(xì)胞瘤多發(fā)于人腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也稱作神經(jīng)膠質(zhì)瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤統(tǒng)計(jì)中占比高達(dá)44.6﹪[1]，且多發(fā)于神經(jīng)中樞深區(qū)部位，具有侵襲性強(qiáng)、惡性增殖等生物學(xué)特性，對周圍腦組織形成持續(xù)性侵犯，呈現(xiàn)浸潤性生長，邊界模糊[2]，惡性率高達(dá)70﹪，具有較高的致殘率和致死率。目前，治療方式主要為手術(shù)切除聯(lián)合放化療方式治療，手術(shù)難度高、難以完全清除瘤細(xì)胞、術(shù)后復(fù)發(fā)率高，同時放化療效果低、副作用高等缺陷，難以改善患者術(shù)后生存質(zhì)量。為抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性發(fā)展[3]，從分子生物學(xué)角度尋找新的治療方法與靶點(diǎn)，是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。本研究探討含同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2，SHP-2）激活突變對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及增殖活性的影響，為抑制腫瘤惡性轉(zhuǎn)變尋找新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、試劑和儀器

人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司），SHP-2HRP抗體（美國Abcam公司），Western blot專用試劑盒（廣州賽誠生物科技有限公司），BCA蛋白定量檢測試劑盒和Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國Invitrogen公司），流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司），Hema 9700梯度基因（PCR）擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），SM 600多功能酶標(biāo)儀（上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司），AUTO 1000自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）構(gòu)建SHP-2 siRNA空載質(zhì)粒

參照http://www.hprd.org/ FOXO3a, http://www.ncbi.nih.gov/網(wǎng)站目的蛋白編碼基因序列及結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)SHP-2空載質(zhì)粒，上游引物：5'-CCGCTCGAG ATGACATCGCGGAG-3'，下游引物：5'-CGCGGAT CCTGTCTGAAACTCTT-3'（由廣州市銳博生物科技有限公司進(jìn)行引物合成）；并以SHP-2空載質(zhì)粒的cDNA編碼序列設(shè)計(jì)pcDNA3.1 SHP-2高表達(dá)質(zhì)粒引物，上游引物為5'-CCGCTCGAGATGACATCGC GGAGATGG-3'，下游引物為5'-CGCGGATCCCGT CTGAAACTTTTCTGCT-3'，并經(jīng)過循環(huán)、延伸反應(yīng)獲得pcDNA3.1 SHP-2高表達(dá)質(zhì)粒模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（T ＞ G）得到 SHP-2D61G mutant質(zhì)粒（由上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Invitrogen測序）。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

U521細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基（含10﹪胎牛血清FBS），置于37℃，含5﹪CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。U521細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)融合至80﹪時，分別加入一定濃度梯度的G418溶液，根據(jù)細(xì)胞死亡情況，確定細(xì)胞全部死亡的G418最低濃度作為最佳篩選濃度。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞密度高于90﹪，活細(xì)胞高于95﹪時，加入重組pcDNA3.1 SHP-2 D61Gmutant質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入U251細(xì)胞，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，經(jīng)篩查得到抗性克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得最佳G418抗性U521穩(wěn)定細(xì)胞系。按照試劑盒說明書操作要求，用Western blot法測定SHP-2蛋白表達(dá)，篩選出SHP-2表達(dá)最明顯的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表明pcDNA3.1 SHP-2 D61Gmutant質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入并顯著表達(dá)，將該轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為突變組；設(shè)pcDNA空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空載組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

（三）指標(biāo)測定

1.細(xì)胞增殖活性：分別取培養(yǎng)0、24和48 h的各組細(xì)胞，每組取3孔，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），避光 37℃培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔滴入120～150 μl DMSO溶液，振蕩至顆粒充分溶解，SP染色后上酶標(biāo)儀于570 nm條件下測定各孔吸光度（A）值，重復(fù)3次，取平均值，作為細(xì)胞增殖活性。

2.細(xì)胞體外侵襲能力：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將 200 μl DMEM（含 0.5﹪FBS）細(xì)胞懸液加入Transwell遷移系統(tǒng)上層小室內(nèi)，下層小室內(nèi)加入600 μl DMEM（含 2﹪FBS），置于 37 ℃，含 5﹪CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)12 h后，清除上層小室側(cè)內(nèi)未遷移細(xì)胞，甲醇固定已過遷移杯孔至杯底下細(xì)胞，染色，清除含細(xì)胞聚碳酸酯膜，并將其反面朝上，使用相差顯微鏡觀察含細(xì)胞聚碳酸酯膜反面朝細(xì)胞情況，拍照并計(jì)數(shù)，取5個視野計(jì)算平均值，重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值評價細(xì)胞侵襲能力。

3.細(xì)胞凋亡：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，各組細(xì)胞分別加入 4 μg/μl順鉑化療藥物、常規(guī)胰酶，調(diào)整細(xì)胞為5×105個/ml，按照試劑盒說明書要求，用Annexin-V/PE雙染法測定細(xì)胞凋亡，紅色為凋亡細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組增殖率即560 nm處光密度A值、侵襲細(xì)胞數(shù)量和凋亡率均以表示，三組間差異采用F檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，組間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染U521細(xì)胞SHP-2蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果表明，第7泳道SHP-2蛋白表達(dá)最明顯（92.75±5.98）﹪，顯著高于其他泳道，表明該轉(zhuǎn)染U521細(xì)胞含有轉(zhuǎn)入的突變基因，并能夠顯著表達(dá)SHP-2蛋白（圖1）。

二、細(xì)胞增殖活性檢測

圖1 western blot檢測轉(zhuǎn)染后神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHP-2蛋白表達(dá)

檢測結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)0 h，各組A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 23.134，P= 0.443），表明各組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞均有增殖，突變組細(xì)胞增殖速度顯著高于對照組和空載組（t= 13.236，16.782，P均＜0.01），培養(yǎng)48 h后，突變組細(xì)胞增殖速度顯著高于對照組和空載組（t=21.337，15.756，P均＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 不同時間各組560 nm處光密度A值對比（±s）

表1 不同時間各組560 nm處光密度A值對比（±s）

注：與對照組比較，aP＜ 0.05；與空載組比較，bP＜ 0.05

分組 0 h 24 h 48 h對照組 0.12±0.06 0.21±0.13 0.31±0.14空載組 0.13±0.05 0.23±0.15 0.34±0.17突變組 0.12±0.05 0.61±0.15ab 0.67±0.16abF值 23.134 9.764 13.022P值 0.443 ＜ 0.01 ＜ 0.01

三、細(xì)胞體外侵襲能力

Transwell小室法測試結(jié)果顯示，空載組與對照組侵襲細(xì)胞數(shù)量（t= 27.535，P= 0.533），突變組侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組和空載組（t= 22.343，26.112，P均＜0.01），表明突變組細(xì)胞體外具有非常強(qiáng)的侵襲運(yùn)動能力（表2，圖2）。

圖2 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞體外侵襲能力（SP染色，×200）

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)量對比

四、細(xì)胞凋亡測試結(jié)果

細(xì)胞凋亡染色結(jié)果顯示，空載組和對照組紅色熒光分布明顯多于突變組，表明細(xì)胞凋亡明顯多于突變組（圖3）；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，對照組和空載組細(xì)胞凋亡率明顯高于突變組（t= 32.267，22.982，P均＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明突變組細(xì)胞活力明顯高于對照組和空載組（圖4）。

圖3 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡（×200倍）

圖4 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

討 論

SHP-2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，在機(jī)體各種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，參與RAS/MARK通路、JAK/STAT通路、PI3K/AKT通路、JNK通路、RHO通路、NF-κB通路和NFAT通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4-6]，是重要的細(xì)胞因子、生長因子以及胞外刺激的信號分子，與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和移動等多種重要的細(xì)胞生命活動的調(diào)控密切相關(guān)。SHP-2突變位點(diǎn)主要集中于N端的SH-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其SH-2結(jié)構(gòu)域由一個含有100個氨基酸殘基的基團(tuán)構(gòu)成，其中最常見的突變是D61G/Y和E76K突變，激活突變能夠?qū)е翽TP與N-SH-2結(jié)構(gòu)域的自身結(jié)合部分或完全解離[5]，造成PTP結(jié)構(gòu)域基因突變，進(jìn)而不同程度增強(qiáng)SHP-2酪氨酸磷酸酶的活性，因此被稱作激活突變[7-9]。

在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中相關(guān)接頭蛋白-2（GAB-2）的分子結(jié)構(gòu)中包含DNA底物的同源結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域由含有多個脯氨酸序列酪氨酸殘基構(gòu)成[10]，因此，其能夠與多種生長因子或細(xì)胞因子相結(jié)合發(fā)生磷酸化反應(yīng)，募集下游信號分子實(shí)現(xiàn)促信號傳導(dǎo)過程[11]。SHP-2通過和接頭蛋白GAB-2相互結(jié)合產(chǎn)生相關(guān)信號通路后被磷酸酶催化，能夠?qū)TKs受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生正調(diào)節(jié)作用；但在特定狀態(tài)下，SHP-2無受體依賴性[12]，N端SH-2結(jié)構(gòu)域，能夠與激酶結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，發(fā)生分子內(nèi)的相互抑制，磷酸酶活性發(fā)生鈍化，從而抑制SHP-2磷酸酶的活性，從而負(fù)向調(diào)節(jié)對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]，從而可得SHP-2能夠?qū)?xì)胞因子及生長因子細(xì)胞信號傳導(dǎo)進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)[14-15]。因此，研究SHP-2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用為臨床治療膠質(zhì)瘤提高參考具有重要意義。

本研究將pcDNA3.1SHP-2D61Gmutant突變型SHP-2質(zhì)粒和pcDNA3.1空載SHP-2顆粒分別轉(zhuǎn)染到神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并檢測各組細(xì)胞增殖活性，侵襲能力以及細(xì)胞凋亡情況。與空載組和對照組相比，突變組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖速度及活力顯著升高（P＜ 0.01），突變細(xì)胞侵襲能力明顯升高（P＜ 0.01），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜ 0.01），結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速度提高、侵襲能力和細(xì)胞活力增強(qiáng)等惡性生物學(xué)行為改變可能與SHP-2激活突變有關(guān)，該研究存在一定不足，試驗(yàn)僅用U251細(xì)胞系進(jìn)行研究，需要增加細(xì)胞系和動物實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步探討SHP-2激活突變與腫瘤惡性行為學(xué)改變的關(guān)系，為臨床抗腫瘤研究提供思路和方向。

1 李培棟, 王新軍, 單嶠, 等. 硼替佐米抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的機(jī)制[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2016, 37(1):57-62.

2 朱勛. 米非司酮對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞活性的作用及機(jī)理的研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2016 .

3 柏燕燕, 史毅, 惠國楨, 等. EphA2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的凋亡、增殖、遷移和侵襲的研究[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2009,36(4):464-470.

4 蔡洪科, 鄧甬川. 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2研究進(jìn)展[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2012, 41(5):581-585.

5 胡中倩, 汪心怡, 儲著朗, 等. SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突變促進(jìn)組織白細(xì)胞浸潤和器官損傷[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 21(12):10-13.

6 Le Page A, Fortin C, Garneau H, et al. Downregulation of inhibitory SRC homology 2 domain-containing phosphatase-1(SHP-1)leads to recovery of T cell responses in elderly[J]. Cell Communication and Signaling, 2014, 12:2.

7 Wardega P, Heldin CH, Lennartsson J. Mutation of tyrosine residue 857 in the PDGF beta-receptor affects cell proliferation but not migration[J]. Cell Signal, 2010, 22(9):1363-1368.

8 姜立彩, 羅建民. 硼替佐米對淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡及SHP-2基因表達(dá)的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2015, 23(4):1026-1029.

9 Zhao WP, Chen QX. Effects of HMGB1 on proliferation and apoptosis of human brain glioma CD133 cells[J]. BratislLekListy, 2015,116(8):480-485.

10 王燦蔚. RNAi干擾Shp2基因?qū)562細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)[D]. 重慶:重慶醫(yī)科大學(xué), 2014 .

11 李輝. SHP-2對膠質(zhì)瘤放射敏感性的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制[D]. 哈爾濱: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué), 2014 .

12 陸志偉, 程玉生, 趙春陽, 等. Shp2在肺腺癌細(xì)胞 A549中的抑癌作用及機(jī)制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(9):1589-1593.

13 趙瑾, 潘雪, 邢玉斐, 等. 可溶性程序性死亡配體1對T淋巴細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 95(6):449-452.

14 Furcht CM, Buonato JM, Skuli N, et al. Multivariate signaling regulation by SHP2 differentially controls proliferation and therapeutic response in glioma cells[J]. J Cell Sci, 2014, 127(Pt 16):3555-3567.

15 陶崑. RNAi干擾Shp2基因?qū)562細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)[D]. 重慶: 重慶醫(yī)科大學(xué), 2014.

Effects of SHP-2 activation on apoptosis and proliferation of human glioma cells

Jiang Wei,Wang Peng, Zuo Wei, Cheng Chao, Zeng Wen, Zhang Liang, Li Weixin. Department of neurosurgery,Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China

ObjectiveTo investigate the effect of SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2（SHP-2）activation mutation on apoptosis and proliferation of human glioma cells,and to find a new target for inhibiting malignant transformation.Methods The design of pcDNA3.1 loaded SHP-2D61Gmutant activating mutation plasmid was transfected into U521 glioma cells, and the cells stably expressing SHP-2 were used as a mutation group. The cells transfected with empty plasmid without activating mutation gene were regarded as an empty group, and non-transfected cells served as a normal control group. Three groups of cells were cultured under the same condition.And the cell proliferation, invasion and cell apoptosis was measured to evaluate the apoptosis and proliferation of glioma cells. Thettest and χ2test were used as statistical analysis, and multiple comparisons between groups were performed by SNK-qtest.ResultsCompared with the normal control group and empty vector group, the proliferation rate and activity of the transfected cells were significantly increased after 24 h（t= 13.236,16.782,P＜ 0.01）; the invasion ability of the mutant cells was significantly increased [（431.25±4.98）vs（66.05 ±5.13）,（t= 22.343,P＜ 0.01）;（431.25±4.98）vs（67.11±5.25）,（t= 26.112,P＜ 0.01）], and the apoptosis rate was significantly reduced（8.23﹪vs33.76﹪, 8.23﹪vs26.77﹪,t= 32.267, 22.982,P＜ 0.01）.ConclusionSHP-2 activating mutation could improve the proliferation rate, invasion ability and cell viability of glioma cells, and change the malignant biological behavior. The result suggested that this protein may be a new target for malignant transformation.

Protein tyrosine phosphatases; Mutation; Glioma; Apoptosis; Cell proliferation

Li Weixin, Email:WX_LiTD@163.com

作者單位：710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科

2017-03-03）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.04.005

李維新，Email：WX_LiTD@163.com

江偉，王鵬，左威，等.SHP-2激活突變對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及增殖影響的研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（4）：214-218.