陳書尚 翁銘芳 王水良 路君 譚建明

補(bǔ)骨脂素對(duì)前列腺癌LNCap-AD細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制研究

陳書尚 翁銘芳 王水良 路君 譚建明

目的觀察補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)的前列腺癌LNCaP-AD細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討補(bǔ)骨脂素抑制前列腺癌的作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)前列腺癌LNCaP-AD細(xì)胞，加入不同濃度的補(bǔ)骨脂素，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞AR mRNA的表達(dá)、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞PCNA和AR蛋白表達(dá)。采用單因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較。結(jié)果與對(duì)照組相比，30、50、100 μg/ml補(bǔ)骨脂素組LNCaP-AD細(xì)胞存活率均明顯下降（P＜ 0.05），補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度-時(shí)間依賴性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（1.00±0.00）相比，30 μg/ml組AR mRNA表達(dá)上調(diào)（1.63±0.04，t= 17.72，P＜ 0.01），50 μg/ml組 AR mRNA 表達(dá)無明顯變化（0.98±0.04，t= 0.66，P= 0.53）、而100 μg/ml組的 AR mRNA 表達(dá)則明顯降低（0.46±0.07，t= 15.18，P＜ 0.01）。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，30 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml的補(bǔ)骨脂素干預(yù) 48 h 后，LNCaP-AD 細(xì)胞 PCNA 蛋白表達(dá)均顯著降低（11.88±0.21vs10.61±0.17vs6.62±0.13vs2.71±0.43,F= 68.53,P＜ 0.01）。100 μg/ml的補(bǔ)骨脂素可明顯降低LNCaP-AD細(xì)胞AR蛋白的表達(dá)水平（0.43±0.06vs0.87±0.04，t= 6.04，P＜ 0.01）。結(jié)論補(bǔ)骨脂素能在體外抑制前列腺癌LNCaP-AD細(xì)胞增殖，且呈劑量-時(shí)間依賴性，其機(jī)制可能與其下調(diào)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA表達(dá)和影響AR表達(dá)有關(guān)。

補(bǔ)骨脂素類； 前列腺腫瘤； 增殖細(xì)胞核抗原； 受體，雄激素

前列腺癌的發(fā)病率和病死率分別居全球男性癌癥的第2位和第6位[1]，近年來在我國(guó)的發(fā)病率也呈逐年遞增趨勢(shì)[2]。從天然藥物中尋找高效低毒的抗癌活性成分，一直以來是新藥研發(fā)的重要途徑。補(bǔ)骨脂素為中藥補(bǔ)骨脂的主要化學(xué)成分，對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制作用，提示其有望成為一種天然抑癌制劑[3-5]。但補(bǔ)骨脂素對(duì)前列腺癌是否有類似作用目前報(bào)道甚少。本研究通過對(duì)體外培養(yǎng)的雄激素依賴性前列腺癌LNCaP-AD細(xì)胞，添加不同濃度的補(bǔ)骨脂素，觀察對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并通過檢測(cè)補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及雄激素受體（androgen receptor，AR）表達(dá)的影響，探討補(bǔ)骨脂素抑制前列腺癌的作用機(jī)制，為尋找前列腺癌新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞及試劑

LNCaP細(xì)胞由第二軍醫(yī)大學(xué)孫穎浩教授惠贈(zèng)，解凍后置于含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5﹪ CO2、90﹪相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90﹪時(shí)，以0.25﹪胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。補(bǔ)骨脂素購自中國(guó)西亞公司，配置方法：20 mg補(bǔ)骨脂素粉末溶于600 μl DMSO保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。主要試劑包括：胎牛血清和RPMI培養(yǎng)基購自美國(guó)HyClone公司，DMSO購自美國(guó)Amresco公司，CCK-8試劑盒購自中國(guó)博士德公司，鼠抗人PCNA抗體購自美國(guó)Cell signaling公司，鼠抗人AR抗體購自美國(guó)SantaCruz公司，鼠抗人β-actin抗體購自美國(guó)Sigma公司，Western bright ECL蛋白顯色液購自美國(guó)Advansta公司，RNA提取試劑盒購自中國(guó)BioFlux公司，EvoScipt RNA SYBR Green I Master試劑盒購自瑞士Roche公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）CCK-8法檢測(cè)LNCaP-AD細(xì)胞增殖抑制率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP-AD細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)8 h，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入終濃度為 0（對(duì)照組），10，30，50，100 μg/ml補(bǔ)骨脂素的細(xì)胞培養(yǎng)液 100 μl，分別培養(yǎng)24、48、72 和 96 h 后，每孔加入 10 μl CCK-8 檢測(cè)溶液和90 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率（T/C﹪）=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A/對(duì)照細(xì)胞A）×100﹪。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值計(jì)算。

（二）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LNCaP-AD細(xì)胞AR mRNA的表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP-AD細(xì)胞，分別加入終濃度為 0（對(duì)照組），30，50，100 μg/ml補(bǔ)骨脂素的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。加入裂解液裂解、過柱、洗滌、洗脫，得到總RNA。反應(yīng)體 系：PCR Grade 10 μl+Master 4 μl+Primer Mix 1 μl，分別加入對(duì)應(yīng)的RNA。定量系統(tǒng)檢測(cè)AR及B-actin mRNA表達(dá)水平。AR引物由中國(guó)華大基因公司合成（表1）。

（三）Western Blot檢測(cè)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA和AR蛋白表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP-AD細(xì)胞，分別加入終濃度為 0（對(duì)照組），30，50，100 μg/ml補(bǔ)骨脂素的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入裂解液提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)10﹪ PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入用1﹪BSA稀釋的一抗（PCNA：1:2 000，AR：1:1 000，β-actin：1:5 000），4℃過夜后，加入與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的相應(yīng)二抗（山羊抗鼠PCNA：1:2 000，山羊抗鼠β-actin：1:10 000）室溫下孵育1 h。依次經(jīng)底物顯色、膠片曝光、掃描儀掃描膠片，Quantity One軟件測(cè)定吸光度，分析算出相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析

采用SPSS12.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CCK-8檢測(cè)結(jié)果、AR mRNA表達(dá)水平、PCNA和AR蛋白表達(dá)水平等數(shù)據(jù)均以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CCK-8法檢測(cè)補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞增殖的影響

如表2所示，在同一作用時(shí)間下，終濃度分別為 0，10，30，50，100 μg/ml的各補(bǔ)骨脂素組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.01）；同一濃度的補(bǔ)骨脂素作用下，各作用時(shí)間的組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.01）。

各組內(nèi)的兩兩比較顯示，與對(duì)照組相比，除了10 μg/ml和 30 μg/ml補(bǔ)骨脂素作用 24 h 以外，其余各組的LNCaP-AD細(xì)胞存活率均顯著降低（P均＜0.05）。隨著作用時(shí)間和濃度的增加，補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞增殖的抑制作用隨之增強(qiáng)，表明補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞的抑制作用具有明顯的濃度-時(shí)間依賴性。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間下補(bǔ)骨脂素體外對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞的生存率的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜ 0.05

分組 例數(shù) 24 h 48 h 72 h 96 h F值 P值10 μg/ml 15 0.96±0.07 0.84±0.05 0.82±0.08 0.65±0.07 19.03 ＜ 0.01 30 μg/ml 15 0.94±0.07 0.80±0.04a 0.77±0.04a 0.63±0.06a 26.03 ＜ 0.01 50 μg/ml 15 0.89±0.09a 0.76±0.13a 0.72±0.09a 0.61±0.08a 6.92 ＜ 0.01 100 μg/ml 15 0.78±0.05a 0.60±0.02a 0.56±0.03a 0.42±0.05a 59.45 ＜ 0.01F值 8.77 24.54 38.95 60.95P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

二、補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞AR mRNA表達(dá)的影響

將不同藥物終濃度的補(bǔ)骨脂素與共培養(yǎng)48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組LNCaP-AD細(xì)胞的AR mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（1.00±0.00）相比，30 μg/ml組 AR mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)（1.63±0.04，t= 17.72，P＜ 0.01），50 μg/ml組 AR mRNA 表達(dá)無明顯變化（0.98±0.04，t= 0.66，P= 0.53）、而100 μg/ml組的AR mRNA表達(dá)則明顯降低（0.46±0.07，t= 15.18，P＜ 0.01，圖 1）。

三、補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA和AR蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，藥物終濃度分別為 30，50，100 μg/ml的補(bǔ)骨脂素干預(yù)48 h后，LNCaP-AD細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)均顯著降低，且隨著補(bǔ)骨脂素濃度的增加，PCNA蛋白表達(dá)抑制更明顯。與對(duì)照組相比，30 μg/ml組AR蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（t= 9.99，P＜ 0.01），50 μg/ml組AR 蛋白表達(dá)無明顯變化（t= 0.79，P＜ 0.01），而100 μg/ml組的 AR 蛋白表達(dá)則明顯降低（t= 6.04，P＜ 0.01，表3，圖 2）。

圖1 補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞AR mRNA表達(dá)的影響（n= 6）

圖2 Western blot法檢測(cè)補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA和AR蛋白表達(dá)的影響

表3 補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較aP＜ 0.05

分組 例數(shù) PCNA AR對(duì)照組 3 0.89±0.05 0.87±0.04 30 μg/ml 3 0.77±0.03a 1.58±0.14a50 μg/ml 3 0.48±0.08a 0.81±0.08 100 μg/ml 3 0.29±0.07a 0.43±0.06aF值 68.53 89.55P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

討 論

補(bǔ)骨脂素是中藥補(bǔ)骨脂種子中的主要成分[3]，屬于呋喃香豆素類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素具有廣泛的生物學(xué)活性及藥理作用，包括光敏、保護(hù)心血管、抗組胺、抗腫瘤、促進(jìn)粒細(xì)胞生長(zhǎng)、抗生育和雌激素樣作用[3-5]。近年來，補(bǔ)骨脂素的抗腫瘤作用越來越受到重視?，F(xiàn)有的體內(nèi)外研究表明，補(bǔ)骨脂素對(duì)多種細(xì)胞株及實(shí)體腫瘤均具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，包括乳腺癌、胃癌、宮頸癌、舌癌、黏液表皮樣癌、白血病和肝癌等[4-6]。然而，補(bǔ)骨脂素在前列腺癌中的作用還未有研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素可以有效抑制LNCaP-AD細(xì)胞增殖，且該抑制作用呈明顯的濃度-時(shí)間關(guān)系，濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用就越強(qiáng)。

PCNA是一種核內(nèi)蛋白，與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，是DNA復(fù)制合成必不可少的物質(zhì)。PCNA在增殖細(xì)胞周期中的含量變化與DNA復(fù)制的時(shí)相變化具有明顯的周期性和一致性，靜止期細(xì)胞表達(dá)很少，G晚期開始增加，S期達(dá)高峰，G2、M期明顯下降，是反映細(xì)胞增殖的重要生物學(xué)指標(biāo)[7]，與多種腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，PCNA在細(xì)胞增殖過程中起重要調(diào)控作用，并參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、染色體重組及DNA甲基化等重要細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PCNA表達(dá)降低可抑制細(xì)胞增殖，而過表達(dá)PCNA則可促進(jìn)細(xì)胞增殖[10-11]。為了探索補(bǔ)骨脂素抑制LNCaP-AD細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究分析了補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響。由于細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)顯示10 μg/ml補(bǔ)骨脂素作用24 h對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞增殖的抑制作用不顯著，而30 μg/ml及以上濃度的補(bǔ)骨脂素作用下，各時(shí)間點(diǎn)的LNCaP-AD細(xì)胞增殖均被明顯抑制，故在觀察補(bǔ)骨脂素對(duì)目標(biāo)分子表達(dá)的影響部分，本研究采用了 30，50，1 000 μg/ml的補(bǔ)骨脂素。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素可降低LNCaP-AD細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性，與補(bǔ)骨脂素抑制LNCaP-AD細(xì)胞增殖的作用一致，提示補(bǔ)骨脂素對(duì)LNCaP-AD細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其降低PCNA的表達(dá)有關(guān)。

AR是核受體超家族一員，雄激素對(duì)靶器官的作用必須通過AR介導(dǎo)[12]。AR信號(hào)通路異常與前列腺癌、良性前列腺增生（BPH）等多種男性特異性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。研究顯示，在前列腺癌組織中，AR介導(dǎo)雄激素促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。此外，盡管前列腺癌細(xì)胞發(fā)生雄激素抵抗的分子機(jī)制還不清楚，但是AR在前列腺癌的不同階段都高表達(dá)，提示AR很可能在前列腺癌細(xì)胞發(fā)生雄激素抵抗的轉(zhuǎn)變過程中起著重要作用[15]。LNCaP陽性表達(dá)AR。研究發(fā)現(xiàn)，采用AR反義寡核苷酸阻斷AR蛋白表達(dá)，可一定程度抑制LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明AR具有調(diào)節(jié)LNCaP細(xì)胞增殖的作用，在前列腺癌的治療中極具價(jià)值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 μg/ml補(bǔ)骨脂素作用48 h后，LNCaP-AD 細(xì)胞AR的mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，其原因和具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。而高濃度（100 μg/ml）的補(bǔ)骨脂素則顯著下調(diào)了LNCaP-AD細(xì)胞AR的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)合文獻(xiàn)[16]，本研究推測(cè)高濃度補(bǔ)骨脂素抑制LNCaP-AD細(xì)胞的增殖，可能部分通過下調(diào)AR表達(dá)而發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素能在體外抑制前列腺癌LNCaP-AD細(xì)胞的增殖，且作用呈時(shí)間-劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與補(bǔ)骨脂素下調(diào)LNCaPAD細(xì)胞的PCNA、影響AR表達(dá)有關(guān)。但補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)的前列腺癌 LNCaP-AD細(xì)胞增殖的抑制作用，是通過何種具體信號(hào)通路，影響細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期等機(jī)制問題，仍需要深入探討。

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Investigation of effect of psoralen on proliferation of prostate cancer LNCap-AD cells and its underlying molecular mechanism

Chen Shushang, Weng Mingfang, Wang Shuiliang, Lu Jun, Tan Jianming.Department of Urology, Fuzhou General Hospital, Xiamen University, Fuzhou 350025,China

ObjectiveTo explore the influence of psoralen on the proliferation of prostate cancer LNCaP-AD cells and its mechanism.Methods Psoralen with different concentration was added into LNCaP-AD cells culturedin vitro. The effect of psoralen on the proliferation inhibition of LNCaP-AD cells was detected by CCK-8. The expressions of AR mRNA and protein, as well as PCNA protein, were respectively determined by real time PCR and Western blot.ResultsCCK-8 test showed that psoralen significantly inhibited the proliferation of LNCaP-AD cells in a dose- and time-dependent manner（P＜ 0.05）. Real time PCR showed that the expression of AR mRNA in LNCaP-AD cells was up-regulated by 30 μg/ml psoralen（1.63±0.04,t= 17.72,P＜ 0.01）, downregulated by 100 μg/ml psoralen（0.46±0.07,t= 15.18,P＜ 0.01）and had no difference by 50 μg/ml psoralen（0.98±0.04,t= 0.66,P= 0.53）when compared with the control group（1.00±0.00）. Western blot showed that the protein expression of PCNA was down-regulated by 30 μg/ml,50 μg/ml and 100 μg/ml psoralen in a dose-dependent manner compared（11.88 ± 0.21vs10.61±0.17vs6.62 ± 0.13vs2.71±0.43,F= 68.53,P＜ 0.01）. The protein expression level of AR was significantly down-regulated by 100 μg/ml psoralen compared with the control group（0.43 ±0.06vs0.87±0.04,t= 6.04,P＜ 0.01）.ConclusionPsoralen can inhibit the proliferation of LNCaPAD cells in a dose- and time-dependent mannerin vitro. The possible mechanism lays in the downregulation of PCNA and the influence of AR expression in LNCaP-AD cells.

Psoralens; Prostatic neoplasms; Proliferating cell nuclear antigen;Receptors, androgen

Chen Shushang, Email:chenshushang@126.com

作者單位：350025 福州，廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院（福州總醫(yī)院）泌尿外科

2017-05-04）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.04.006

國(guó)家自然科學(xué)基金青年創(chuàng)新基金（81402107）；福建省自然基金面上項(xiàng)目（2016J01475）

陳書尚，Email：chenshushang@126.com

陳書尚，翁銘芳，王水良，等. 補(bǔ)骨脂素對(duì)前列腺癌LNCaP-AD細(xì)胞及增殖細(xì)胞核抗原、雄激素受體表達(dá)的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（4）：219-223.