任海燕，杜學(xué)梅，李登科,王永康，薛曉芳，趙愛玲，隋串玲,弓桂花(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點實驗室，山西太谷 030815)

棗幼胚體細胞胚的發(fā)生及植株再生

任海燕，杜學(xué)梅，李登科,王永康，薛曉芳，趙愛玲，隋串玲,弓桂花
(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點實驗室，山西太谷 030815)

以小梨棗胚齡30～40 d的幼胚為外植體，研究不同質(zhì)量濃度6-芐基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆(TDZ)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、脫落酸(ABA)及其組合對幼胚胚乳看護培養(yǎng)效果、體細胞胚發(fā)生、成熟及萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，適宜小梨棗幼胚(30～40 d)胚乳看護培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+IBA0.2 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1，成胚率達62.07%；誘導(dǎo)胚性愈傷組織較適宜的培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.6 mg·L-1+IBA1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)率為53.32%；在MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1組合下有利于體細胞胚的發(fā)生，發(fā)生率可達71.43%；ABA可促進體胚的正常發(fā)育，質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時，體細胞胚結(jié)構(gòu)完整，體胚成熟率為21.83%；將成熟的體胚轉(zhuǎn)接到含有IBA 0.03 mg·L-1+GA30.03 mg·L-1的培養(yǎng)基中，體細胞胚萌發(fā)形成完整植株。

棗; 幼胚; 體細胞胚的發(fā)生; 植株再生

植物體細胞胚胎發(fā)生現(xiàn)象普遍存在，是離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的有效途徑[1]。長期以來，植物體胚發(fā)生技術(shù)已成為快速繁殖和制作人工種子的重要手段。另外，體細胞再生植株的最初來源是單個胚性細胞，能夠克服遺傳嵌合及后代分離問題，對于進行基因工程或細胞工程育種有著重要意義。以棗胚為外植體經(jīng)體細胞胚發(fā)生獲得植株的研究國內(nèi)外有一些報道[2]，陳維倫等[3]對酸棗胚進行無性胚狀體發(fā)生并獲得植株；李登科等[4]對‘六月鮮’棗幼胚進行離體培養(yǎng)，成功獲得了胚狀體及再生苗；郝建平等[5]對‘晉矮1號’等棗合子胚和體細胞胚發(fā)育過程進行觀察與比較。張存智[6]以胚齡50～60 d‘隴東馬牙棗’為試材成功誘導(dǎo)出胚狀體及再生苗植株。據(jù)已有報道，幼胚較適宜作為體胚發(fā)生的外植體，但目前關(guān)于棗幼胚體胚發(fā)生條件和幼胚的發(fā)育形成過程缺乏系統(tǒng)性研究。本試驗以‘小梨棗’胚齡30～40 d幼胚為外植體，研究不同激素組合對胚性細胞誘導(dǎo)、體胚形成和發(fā)育過程的影響，試圖闡明其體胚發(fā)生所需的激素配比條件和幼胚的發(fā)生發(fā)育規(guī)律，為拯救早期敗育幼胚、創(chuàng)建新種質(zhì)資源及體胚途徑的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料‘小梨棗’為可育率較高的棗品種，采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家棗資源圃，試驗于2013-2015年進行，‘小梨棗’盛花期為6月上旬，在盛花期選取黃蕾期開放的棗花掛牌標(biāo)記為定花，由定花所結(jié)得果為定果，根據(jù)定花和定果確定胚齡。以王群瑛[7]棗胚發(fā)育過程的觀察為依據(jù)，并結(jié)合石蠟切片觀察，確定胚齡30～40 d胚胎發(fā)育階段為球形胚后期。采集30～40 d 的幼果。

幼果于潔凈水中泡洗后流水沖洗1～1.5 h，在超凈工作臺上置于無菌三角瓶或燒杯中，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡20～30 s，無菌水洗1～2次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%HgCl2振蕩2.5～3 min，無菌水洗4～5次，然后用手術(shù)刀將棗果剖開，取出胚珠，剝?nèi)ネ獗砥ず笠院宵c端插入培養(yǎng)基的豎放方式接種在培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度為24 ℃±2 ℃，光照時間14 h·d-1，光照度3 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 胚乳看護條件的優(yōu)化 將去除表皮的胚珠接種在MS培養(yǎng)基中，不同質(zhì)量濃度的激素配比采用L9(34)正交設(shè)計(表1)，添加0.5 g·L-1水解乳蛋白(Hydrolyzed milk protein,LH)， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%蔗糖,5.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。研究不同激素組合對合子胚培養(yǎng)效果的影響。30 d后調(diào)查成胚率，以形成可見胚或沿胚性生長的百分率為成胚率。

表1 正交設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels of hormone composition in orthogonal design for immature embryo culture of jujube varieties

1.2.2 幼胚愈傷組織的誘導(dǎo) 將經(jīng)胚乳看護培養(yǎng)形成的幼胚從胚珠中取出，接種在愈傷組織誘導(dǎo)的MS培養(yǎng)基上，添加不同質(zhì)量濃度的TDZ、IBA、NAA激素組合(表2)， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%蔗糖，5.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。研究不同激素組合誘導(dǎo)愈傷組織的效果。黑暗條件培養(yǎng)6～7 d后轉(zhuǎn)到正常培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，40 d后觀察愈傷組織生長情況，統(tǒng)計其誘導(dǎo)率。以產(chǎn)生愈傷組織胚數(shù)占接種幼胚個數(shù)的百分?jǐn)?shù)為誘導(dǎo)率(%)。

1.2.3 體細胞胚的發(fā)生 將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的6-BA、IBA、NAA激素組合，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%蔗糖， 0.5 g·L-1LH， 5.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)20 d 后觀察胚性愈傷組織的生長情況并統(tǒng)計體細胞發(fā)生率(%)，即體細胞胚數(shù)量占接種的胚性愈傷組織數(shù)的百分率。

1.2.4 體細胞胚的成熟與萌發(fā) 將形成的體細胞胚置于MS培養(yǎng)基中，添加質(zhì)量濃度為0.0～1.0 mg·L-1ABA， 0.5 g·L-1LH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%蔗糖， 5.5 g·L-1瓊脂。培養(yǎng)20 d后觀察體細胞胚成熟的形成過程并統(tǒng)計體細胞胚成熟率，即成熟體細胞胚數(shù)占接種體細胞胚總數(shù)的百分率。

將成熟的體細胞胚胎接種在含質(zhì)量濃度0.3 mg·L-1GA3+0.3 mg·L-1IBA的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察體細胞胚萌發(fā)過程。

1.2.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析和差異比較，用Excel 2003處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚乳看護培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由表2可知，在處理2的激素條件下，幼胚成胚率為62.07%，極顯著高于其他處理。在IBA0.5 mg·L-1+BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1(處理6)條件下，成胚率僅次于處理2，為56.27%，但有少數(shù)胚珠愈傷化。在IBA0.8 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1(處理8)條件下，胚珠內(nèi)幼胚生長緩慢或枯萎，幼胚成胚率最低為34.37%。當(dāng)添加IBA0.8 mg·L-1+BA1.0 mg·L-1(處理9)時，成胚率為46.36%，其中少數(shù)胚珠基部膨大，幼胚畸形發(fā)育呈細長條狀。表明，較適宜‘小梨棗’幼胚生長的激素配比為IBA0.2 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，成胚率達62.07%。

表2 不同激素配比對‘小梨棗’幼胚成胚率的影響Table 2 Effects of different hormone combinations on embryo rate of Chinese jujube

注：Duncan’s新復(fù)極差檢驗，不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note:Data was analyzed by Duncan’s multiple new range test,the different letter indicate significant difference at 0.01 level.The same below.

2.2 激素組合對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

經(jīng)胚乳看護培養(yǎng)后，將幼胚完整剝離，接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上。培養(yǎng)40 d后，愈傷組織逐漸產(chǎn)生并生長。觀察發(fā)現(xiàn)，添加0.4 mg·L-1TDZ的處理中，愈傷組織增殖變大，質(zhì)地較緊密，瘤狀，呈黃綠色，利于器官發(fā)生途徑分化不定芽，但未形成胚性愈傷組織。其余處理均不同程度地誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織。由表3可以看出，TDZ0.6 mg·L-1+IBA1.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1的激素組合，利于誘導(dǎo)形成淡黃色、顆粒狀、易分離的胚性愈傷組織(圖1-A)，誘導(dǎo)率為53.32%。

2.3 激素組合對幼胚體細胞胚發(fā)生的影響

將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至含有不同質(zhì)量濃度的6-BA、IBA、NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生。經(jīng)過20 d培養(yǎng)，愈傷組織上陸續(xù)形成肉眼可見的不同發(fā)育時期的體細胞胚(圖1-B)。附加不同激素組合對‘小梨棗’幼胚體細胞的發(fā)生有重要的影響(表4)，體胚發(fā)生率因激素配比的不同而存在明顯差異,其中生長情況也表現(xiàn)明顯差異(圖1- F～I)。結(jié)果表明，在6-BA0.3 mg·L-1與NAA 0.02 mg·L-1組合處理下，體胚發(fā)生率可達71.43%，并且在誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生的同時，胚性愈傷組織也在不斷地增殖。

表3 不同激素組合對‘小梨棗’幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on embryogenic callus induction in Chinese jujube

A.胚性愈傷組織誘導(dǎo) Embryonic callus；B.體細胞胚的發(fā)生 Somatic embryogenesis；C.體細胞胚的成熟 Somatic embryo maturation；D，E.體細胞胚的萌發(fā) Somatic embryo germination；F.有體細胞胚產(chǎn)生,部分畸形發(fā)育 Somatic embryos with partial abnormal tissue；G.形成白色石細胞,不利于后期萌發(fā) The formation of white stone cells which are harmful to germination；H.胚性愈傷組織發(fā)育緩慢,無體細胞胚產(chǎn)生 Embryogenic callus development without somatic embryos; I.有體細胞胚發(fā)生,其中少數(shù)畸形發(fā)育 Some embryo produced and a few of them were abnormal

圖1‘小梨棗’幼胚體細胞胚的發(fā)生
Fig.1ThesomaticembryogenesisofZiziphusjujuba‘Xiaolizao’

表4 不同激素組合對‘小梨棗’幼胚體細胞發(fā)生的影響Table 4 Effects of different hormone combinations on somatic embryogenesis in Chinese jujube

2.4 體細胞胚的成熟與萌發(fā)

對增殖培養(yǎng)好的胚性愈傷組織，置于含有不同質(zhì)量濃度的ABA的成熟分化培養(yǎng)基中。在分化與成熟培養(yǎng)的過程中，體胚外觀表現(xiàn)為白色，發(fā)育程度不一，有呈球形或呈長圓柱形，易于分離。20 d后形成白色棒狀結(jié)構(gòu)，逐漸轉(zhuǎn)發(fā)育形成胚芽、胚軸與胚根的完整胚狀體結(jié)構(gòu)(圖1-C)，即為成熟體細胞胚。由表5可以看出，在ABA質(zhì)量濃度不同的成熟培養(yǎng)基上，胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化為成熟體細胞胚的能力不同。隨著質(zhì)量濃度的升高，體胚的誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時，體細胞胚結(jié)構(gòu)完整，質(zhì)量較好，體細胞胚成熟率為21.83%。ABA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時易形成畸形胚，且體胚數(shù)量降低。

將體胚接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上，10 d后觀察發(fā)現(xiàn)，子葉不斷發(fā)育和伸長變綠，頂端胚芽開始生長，胚根伸長，體胚萌發(fā)形成完整植株(圖1-D,E)。

表5 不同質(zhì)量濃度ABA處理獲得‘小梨棗’成熟體胚的情況Table 5 Maturation rate of somatic embryos of Chinese jujube under different mass concentration of ABA

3 討 論

體細胞胚的發(fā)生與外植體的來源和發(fā)育狀態(tài)密切相關(guān)。Vikrant[8]認為未成熟合子胚因其細胞全能性高、脫分化容易，在誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生時具有顯著優(yōu)勢。Ruan等[9]也認為分化程度較低的組織，如未成熟胚，更利于體細胞胚的誘導(dǎo)發(fā)生。但耿菲菲等[10]認為在幼胚的發(fā)育過程中，只有一個較短的階段具有很強的體胚發(fā)生潛能。本研究將‘小梨棗’胚齡30～40 d幼胚經(jīng)胚乳看護培養(yǎng)后，再進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、體胚的發(fā)生、成熟和萌發(fā)，最終獲得完整植株，從而建立棗幼胚體細胞胚發(fā)生及植株再生體系。這為今后進行棗快速繁育、遺傳改良及基因轉(zhuǎn)化有著重要意義。另外，利用棗幼小胚獲得體細胞胚再生植株，為結(jié)合棗胚早期敗育嚴(yán)重的問題，進行優(yōu)良品種幼小胚的拯救奠定了基礎(chǔ)。

植物體細胞胚發(fā)生是一個極其復(fù)雜的過程，植物激素是影響體細胞胚發(fā)生的重要因素。ABA是調(diào)節(jié)胚胎晚期的發(fā)育的關(guān)鍵因素，能促進體細胞胚的成熟和抑制畸形胚的發(fā)生，防止裂生多胚的產(chǎn)生，ABA在針葉樹種、龍眼、胡蘿卜、玉米、枸杞等植物體胚發(fā)生過程中的作用已有較多研究[11]。李玲等[12]認為體細胞胚發(fā)育需要一個生理上成熟的培養(yǎng)階段才能正常萌發(fā)，添加ABA1.0 mg·L-1在橡膠次生體細胞胚成熟過程中起到促進作用。齊力旺等[13]添加16 mg·L-1ABA時，有利于華北落葉松體細胞胚的產(chǎn)生。Stasolla等[14]的研究表明，ABA與滲透調(diào)節(jié)劑PEG配合使用,可促進針葉樹胚狀體的分化與成熟。ABA的這一作用主要在于其能抑制細胞的不正常的擴大，從而使體胚能正常的發(fā)育和成熟[15-16]。但也有學(xué)者[17-19]得出不同的結(jié)論，認為ABA能夠抑制體胚的發(fā)生。關(guān)于ABA在棗體胚發(fā)生過程中作用的研究還未見詳細報道。本試驗中添加0.5 mg·L-1時，體細胞胚結(jié)構(gòu)完整，并產(chǎn)生較多的次生胚，促進了體胚的成熟。在體細胞發(fā)育過程的不同階段，對ABA反應(yīng)不同[20]，今后還需進一步研究在體胚不同時期ABA作用的最佳質(zhì)量濃度，深入探討其在棗體胚發(fā)生過程中的作用機制，進而為提高棗育種效率提供理論依據(jù)。

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IndirectSomaticEmbryogenesisandPlantRegenerationfromYoungEmbryosofZiziphusjujubaMill.

REN Haiyan,DU Xuemei,LI Dengke,WANG Yongkang,XUE Xiaofang,ZHAO Ailing,SUI Chuanling and GONG Guihua
(Shanxi Key Laboratory of Genetic Improvement and Use of Pomology,Research Institute of Pomology,Shanxi Academy of Agricultural Science,Taigu Shanxi 030815,China)

The 30-40 d-aged young embryos at globular stage ofZiziphusjujuba‘Xiaolizao’ were used as explants and cultured in MS basic medium with different kinds of plant hormones. The effects of different combinations of plant hormones,including 6-BA,TDZ,IBA,NAA and ABA,on endosperm nursing culture,somatic embryogenesis,somatic maturation and somatic germination were studied in vitro culture. The results showed that the suitable hormone combination for endosperm nursing culture of ‘Xiaolizao’ immature embryos(30-40 d) was IBA0.2 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1，with the embryo formation rate of 62.07%; the most suitable medium to induce embryogenic callus was TDZ0.6 mg·L-1+IBA1.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1with the induction rate of 53.32%; the hormone combination of somatic embryogenesis was 6-BA0.3 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1with the somatic embryogenesis rate of 71.43%; ABA can promote the normal development of somatic embryos,and when the mass concentration is 0.5 mg·L-1,and the somatic embryo maturation rate is 21.83% with the complete somatic embryo structure; the mature somatic embryos were transferred to the culture medium contraining IBA 0.03 mg·L-1+GA30.03 mg·L-1to germinate and the complete plants were obtained.

Chinese jujube; Young embryo; Somatic embryogenesis; Plant regeneration

2016-06-03

2016-08-25

The National Science-technology Support Plan Projects(No.2013BAD14B030103);Shanxi Youth Science and Technology Research Fund(No.2015021163);Shanxi Science and Technology Innovation Team(No.2013131017).

REN Haiyan,female,assistant research fellow.Research area:germplasm resources and breeding of Chinese jujube.E-mail:haiyan_101012@163.com

S665.1

A

1004-1389(2017)09-1349-06

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕Responsibleeditor:PANXueyan)

日期：2017-09-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.024.html

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國家科技支撐計劃(2013BAD14B030103)；山西省青年科技研究基金(2015021163)；山西省科技創(chuàng)新重點團隊項目(2013131017)。

任海燕，女，助理研究員，研究方向為棗種質(zhì)資源與育種。E-mail:haiyan_101012@163.com

杜學(xué)梅，女，副研究員，從事棗種質(zhì)資源與育種研究。E-mail:sxgsbjbdu@163.com

CorrespondingauthorDU Xuemei,female,associate research fellow.Research area:germplasm resources and breeding of Chinese jujube.E-mail:sxgsbjbdu@163.com