孟 姣，張存旭，孫 琳，戎旭旭

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵712100）

植物體細胞胚胎發(fā)生是指體細胞獲得胚狀體的過程，這一過程包括胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性組織的增值及保持、成熟培養(yǎng)和體胚植株的轉(zhuǎn)化及萌發(fā)幾個不同階段。在誘導(dǎo)階段，通常需要將植物材料置于控制條件下進行培養(yǎng)，促使細胞分化，形成胚性細胞。然而，在誘導(dǎo)過程中會出現(xiàn)2種不同類型的愈傷組織：一種為胚性愈傷組織，這種愈傷組織具有產(chǎn)生胚狀體的能力，生長較快，可通過體胚發(fā)生途徑再生植株；另一種為非胚性愈傷組織，它是具分生能力的一團不規(guī)則細胞，生長較慢，可通過器官發(fā)生途徑形成芽或根［1］。盡管這2種類型的愈傷組織通常根據(jù)其形態(tài)、顏色可加以區(qū)別，但在體胚發(fā)生中人們更關(guān)心的是體細胞如何轉(zhuǎn)變?yōu)榫吲咝阅芰Φ募毎?。為此，前人在生理生化機理方面進行了探討。研究發(fā)現(xiàn)胚性和非胚性愈傷組織在內(nèi)源游離氨基酸、多胺、蛋白質(zhì)、同工酶、淀粉含量及ADP-焦磷酸化酶等方面均存在差異［2］。Nieves對甘蔗胚性和非胚性愈傷組織的研究發(fā)現(xiàn)，胚性組織中腐胺／（亞精胺+精胺）的比值比非胚性的高［1］。對銀杉的研究發(fā)現(xiàn)，胚性組織中谷氨酸脫氫酶的活性顯著高于非胚性組織［3］。辛福梅［4］等人在對栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織抗氧化物酶活性的研究中發(fā)現(xiàn)，胚性組織中抗氧化物酶活性均明顯高于非胚性組織。以栓皮櫟的胚性和非胚性愈傷組織為試驗材料，通過對碳水化合物和酶活性的比較研究，分析2種愈傷組織的不同生化特性，以期為進一步建立愈傷組織的胚性發(fā)生能力與生化代謝間的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集未成熟堅果，剝?nèi)ざ?，表面消毒后在無菌條件下剝?nèi)『献优?，撕掉膜質(zhì)種皮，將裸露的合子胚以全胚胚根向下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（MS基本培養(yǎng)基，附加0.5mg·L-16-BA，0.5mg·L-12，4-D和0.5mg·L-1PVP［5］），于 （25±1）℃ 暗 培 養(yǎng)。1個月后，將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上（MS基本培養(yǎng)基，附加1.0mg·L-16-BA，0.25 mg·L-1NAA，200mg·L-1水解酪蛋白和400mg·L-1谷氨酰胺［5］），16h光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)1個月。在體視顯微鏡下，根據(jù)顏色、形態(tài)、質(zhì)地特征，分別選取胚性和非胚性愈傷組織，作為研究的材料（圖1）。

1.2 測定指標(biāo)

1.2.1 可溶性糖含量 胚性和非胚性愈傷組織65℃烘干，分別稱取100mg，加入80%乙醇溶液，80℃水浴30min，3 500g離心10min，浸提3次，采用蒽酮比色法測定［6］。

圖1 （a）栓皮櫟胚性愈傷組織（色澤淺黃，質(zhì)地較疏松，表面光滑，呈有光澤的顆粒狀或塊狀）（b）非胚性愈傷組織（米白色或淡綠色，質(zhì)地較堅硬，表面粗糙干燥，呈無光澤的瘤狀）Fig.1 （a）embryogenic callus（pale yellow，loose texture，smooth surface，shiny，granule or block）and（b）non-embryogenic callus（beige or light green，hard texture，rough surface，dull，nodule）of Quercus variabilis

1.2.2 淀粉含量 向以上提取過可溶性糖的沉淀中加入2mL蒸餾水，沸水浴糊化15min，冷卻后加入2mL 9.2mol·L-1HClO4，4 000g 離心 10 min，浸提2次，采用蒽酮比色法測定［6］。

1.2.3 可溶性蛋白含量 胚性和非胚性愈傷組織65℃烘干，分別稱取100mg，加入少許石英砂和蒸餾水研磨，5 000g離心10min。上清液即為蛋白質(zhì)提取液，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定［6］。

1.2.4 水溶性蛋白分子量 分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重50mg，加入pH7.5的0.05M的磷酸鈉緩沖液300μL，研磨，15 000g離心10min，上清液即為水溶性蛋白提取液［7-8］。

電泳采用SDS-PAGE，10%的分離膠與5%的濃縮膠制板。進樣量每孔20μL，以溴酚蘭作為指示劑。恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍指示劑距膠底部2cm時，停止電泳，剝下膠片后，固定液中固定，考馬斯亮藍R-250染色過夜，脫色液中脫色并照相。

1.2.5 蛋白酶活性 分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重2 000mg。按1∶4比例加入pH7.0的磷酸緩沖液，研磨。4 000g離心10min，上清液為待測酶液。酶活力的測定采用福林-酚法［9］。

1.2.6 游離脯氨酸含量 分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重500mg，加入5mL 3%的磺基水楊酸溶液，沸水浴中提取15min，過濾。采用磺基水楊酸法測定［6］。

1.2.7 總多酚含量 參考李煥秀［10］的研究方法，并進行改進。分別稱取胚性和非胚性愈傷組織鮮重200mg，剪碎后進行研磨提取，提取液為50%的乙醇（pH=3.0），充分提取后過濾，濾液用于測定總多酚的含量。檢測波長為270nm，以鄰苯二酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每克鮮樣中總酚的毫克數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，在SPSS 17.0中對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用t檢驗對2種類型愈傷組織生化指標(biāo)含量進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖含量的差異

糖是高等植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化的一種重要形式，在植物體內(nèi)的含量和種類極其豐富，對植物的生長發(fā)育具有重要作用。可溶性糖不僅作為滲透調(diào)節(jié)劑影響體細胞胚胎的誘導(dǎo)和發(fā)育，而且作為一種能源物質(zhì)為細胞代謝提供能量。

栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織可溶性糖含量測定結(jié)果見表1，結(jié)果顯示栓皮櫟胚性愈傷組織可溶性糖含量為97.6mg·g-1，顯著高于非胚性愈傷組織可溶性糖含量。

表1 栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織生化特性及t測驗Table 1 Mean values of biochemical character and t-test of embryogenic and non-embryogenic calli

2.2 淀粉含量的差異

淀粉是一種天然多糖化合物，以淀粉顆粒的形式廣泛存在于植物的果實、根、莖、葉中。作為植物體內(nèi)最普遍的一類儲藏物質(zhì)，積極參與組織培養(yǎng)過程和形態(tài)建成，其消長與組織分化及器官形成具有密切的關(guān)系。從表1可以看出，栓皮櫟胚性愈傷組織的淀粉含量為25.3mg·g-1，顯著大于非胚性愈傷組織。

2.3 可溶性蛋白含量的差異和譜型分析

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，在細胞和生物體的生命活動過程中，起著十分重要的作用。可溶性蛋白質(zhì)作為重要的儲藏物質(zhì)，在體細胞胚胎發(fā)生過程中具有重要的研究意義。從表1可以看出，栓皮櫟胚性愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著大于非胚性愈傷組織，兩者相差約1倍。

從SDS-PAGE電泳圖譜分析可知（圖2），胚性愈傷組織中蛋白條帶數(shù)比非胚性的多，且染色較深。兩者共有的條帶分子量分別為122、69、62.5、53.1 KD和33.7KD，但分子量為66.2、43.1KD和41.1 KD的蛋白條帶僅出現(xiàn)在胚性愈傷組織，在非胚性愈傷組織未發(fā)現(xiàn)特有蛋白條帶。

圖2 可溶性蛋白電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of soluble protein

2.4 蛋白酶酶活的差異

蛋白酶廣泛存在于植物中，蛋白酶中含有多種不同蛋白水解酶組分，對多種蛋白質(zhì)及多肽具有催化水解活性，蛋白酶酶活是細胞代謝活動的一個重要指標(biāo)。

栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織蛋白酶酶活的測定結(jié)果（表1）顯示，栓皮櫟胚性組織中蛋白酶酶活為0.231U·mg-1，非胚性的蛋白酶酶活為0.228 U·mg-1。可見，栓皮櫟胚性組織的蛋白酶酶活高于非胚性，但是未達到顯著水平。

2.5 游離脯氨酸含量的差異

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以作為活性氧的清除劑，還具有降低細胞內(nèi)酸度、調(diào)節(jié)氧化還原電勢以及作為細胞內(nèi)酶的保護劑等作用。由表1可以看出，栓皮櫟胚性組織中游離脯氨酸含量顯著高于非胚性。

2.6 總多酚含量的差異

多酚類物質(zhì)包括酚酸、黃酮、花青素、單寧、兒茶素等，是植物的酚類次生代謝產(chǎn)物。由表1可知，栓皮櫟非胚性愈傷組織的總多酚含量為3.3mg·g-1，顯著高于胚性愈傷組織。

3 結(jié)論與討論

植物體細胞胚胎的發(fā)生需要經(jīng)過幾個不同的階段，每個階段都伴隨著一系列生理生化變化，這些變化在形態(tài)轉(zhuǎn)變之前即已發(fā)生。栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織在顏色、質(zhì)地、形態(tài)方面的差異與其組織內(nèi)部物質(zhì)變化有密切的聯(lián)系。

體胚中可溶性糖含量水平標(biāo)志著源端的同化物供應(yīng)能力和庫端對同化物的轉(zhuǎn)化、利用能力。因此可溶性糖在植物的體細胞胚胎發(fā)生中具有重要作用。栓皮櫟胚性組織可溶性糖含量顯著高于非胚性組織說明：胚性組織新陳代謝速率高于非胚型愈傷組織，高含量的可溶性糖為胚型愈傷組織分化產(chǎn)生胚胎提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與Nieves等人在甘蔗中的報道一致［2］，但與張獻龍［11］等在陸地棉中的研究結(jié)果不相符。張獻龍［11］等研究顯示陸地棉胚性組織的可溶性糖含量低于非胚性，但胚性組織的蛋白質(zhì)和RNA含量高于非胚性。該結(jié)果說明胚性愈傷組織代謝旺盛，能及時把從培養(yǎng)基獲得的糖分轉(zhuǎn)化成細胞分裂和分化所必需的RNA和蛋白質(zhì)。這2種不同結(jié)果的可能原因是取樣的時間不同。本試驗和Nieves的試驗都是在誘導(dǎo)2個月后取樣，而張獻龍［11］等人是在3個月后取樣。李茜［12］等人對白皮松愈傷組織生理生化特性的研究表明，在體細胞誘導(dǎo)過程中，胚性組織可溶性糖的含量會在一段時間后出現(xiàn)一個高峰，隨后含量會下降而低于非胚性組織，因此取樣時間對試驗結(jié)果有重要的影響。

研究表明淀粉含量與胚胎發(fā)生能力呈正相關(guān)［13］。栓皮櫟胚性組織的淀粉含量顯著大于非胚性，說明胚性細胞胚胎發(fā)生能力強。對馬唐愈傷組織的組織學(xué)觀察表明，胚性組織中淀粉粒多，非胚性中淀粉粒很少，兩者相差10～40倍［2］。此外，對馬唐淀粉酶的研究表明胚性組織中淀粉酶種類多、活力高，則能催化較多的淀粉水解，以保證糖代謝的底物供應(yīng)，為胚胎發(fā)生提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。這與本研究中栓皮櫟胚性組織的淀粉含量高于非胚性的結(jié)果相符。

栓皮櫟胚性組織可溶性蛋白質(zhì)的含量約為非胚性組織的2倍。表明胚性組織中蛋白質(zhì)合成較旺盛，非胚性中蛋白質(zhì)合成較少。

分子量為122、69、62.5、53.1KD和33.7KD等的蛋白質(zhì)條帶在2種愈傷組織中均有出現(xiàn)，說明這些蛋白可能是對細胞結(jié)構(gòu)建成很重要的蛋白。分子量為66.2、43.1KD和41.1KD等的蛋白質(zhì)只在胚性組織中出現(xiàn)或在非胚性中含量很低，說明這部分蛋白與體胚發(fā)生過程密切相關(guān)，可能是催過該過程的重要酶類。齊力旺［14］等研究表明胚性組織中游離氨基酸含量低于非胚性，胚性組織中游離氨基酸庫較小，非胚性的游離氨基酸庫較大，說明胚性組織能將大量的游離氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)以備細胞分化之用。

栓皮櫟2種愈傷組織蛋白酶活的測定結(jié)果與Nieves［2］等在甘蔗中的報道一致，甘蔗胚性愈傷組織蛋白水解酶酶活為0.3U·mg-1，非胚性的蛋白水解酶酶活為0.2U·mg-1，未達到顯著差異水平。胚性組織中高活性的蛋白酶有利于蛋白質(zhì)的降解，為新蛋白質(zhì)的合成提供氨基酸，為愈傷組織的快速生長和體胚發(fā)生提供物質(zhì)條件。

H2O2作為活性氧的一種重要形式，是細胞有氧代謝的產(chǎn)物。微量的H2O2可在生物體的生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，特別是在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，但過量的H2O2具有損傷生物大分子、毒害細胞的效應(yīng)。滲透性調(diào)節(jié)物脯氨酸作為活性氧的清除劑是植物對逆境脅迫的一種適應(yīng)和保護措施。胚性組織游離脯氨酸含量顯著高于非胚性，說明胚性細胞的蛋白質(zhì)、核酸、酶、脂膜的穩(wěn)定性高于非胚性，適應(yīng)性、抗逆性較非胚性強，為下一步體細胞胚胎的的產(chǎn)生創(chuàng)造了有利條件。研究表明作為另一類活性氧的清除劑，栓皮櫟胚性組織中過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性也顯著高于非胚性［4］。

多酚的主要功能是抗氧化，清除自由基。A.M.Maira［15］等進行花卉組培時發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)的含量與其褐變率成正相關(guān)，而褐變會抑制愈傷組織的生長甚至導(dǎo)致死亡。相關(guān)研究表明多酚氧化酶在非胚性愈傷組織中表現(xiàn)出較高的活性［12］，多酚類化合物氧化產(chǎn)生的醌類物質(zhì)使非胚性組織代謝減弱、膜透性增加，從而抑制細胞分化、導(dǎo)致生長緩慢、胚胎發(fā)生能力弱。N.Nieves［1］等研究表明沒食子酸是2種類型愈傷組織中最主要的酚酸，而且沒食子酸在非胚性組織中的含量顯著高于胚性，這與本試驗結(jié)果一致。

本研究通過對栓皮櫟胚性和非胚性組織生理生化特性的比較發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織的物質(zhì)代謝活性遠高于非胚性組織，為體胚的發(fā)生提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。本試驗初步揭示了植物體細胞胚胎發(fā)生的生化基礎(chǔ)，為建立愈傷組織的胚性發(fā)生能力與生化代謝間的關(guān)系提供了依據(jù)。但要進一步揭示植物體細胞胚胎發(fā)生的機理需要探討其分子基礎(chǔ)，掌握細胞分化過程中有關(guān)蛋白質(zhì)和酶的動態(tài)變化規(guī)律。

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