朱貝貝 （山東省即墨市海洋與漁業(yè)局 266200）

方 皓 李 煜 吳佳燕 王雪鵬* （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 泰安）

文蛤病原菌哈氏弧菌的分離鑒定與藥敏試驗

朱貝貝 （山東省即墨市海洋與漁業(yè)局 266200）

方 皓 李 煜 吳佳燕 王雪鵬*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 泰安）

本文從山東某文蛤養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病的文蛤體內(nèi)分離鑒定出一株哈氏弧菌，本研究對該菌形態(tài)、生理生化特征、16SrDNA及致病性進行了初步分析，在NCBI上比對結(jié)果顯示該菌為哈氏弧菌。人工感染健康的文蛤，該菌能引起文蛤發(fā)病的，死亡率高達80%，且發(fā)病癥狀與養(yǎng)殖區(qū)文蛤的發(fā)病癥狀相同，由此表明，該菌是引起文蛤發(fā)病的病原菌。該菌對對18種藥物有不同程度的耐藥性。對萘定酸、氯霉素表現(xiàn)為高度敏感，哌拉西林、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為敏感，慶大霉素為中度敏感，阿莫西林表現(xiàn)為耐藥。

文蛤 哈氏弧菌 16SrDNA 藥敏試驗

文蛤(Meretrix meretrix)是我國沿海重要的經(jīng)濟貝類，是我國沿海開發(fā)灘涂、發(fā)展貝類養(yǎng)殖的理想對象，具有廣闊的市場前景和較高的經(jīng)濟價值。與其他養(yǎng)殖貝類一樣，文蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)也正在面臨著病害帶來的負(fù)面影響，造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失?；【菍?dǎo)致文蛤發(fā)病的主要致病菌之一。本研究對發(fā)病的文蛤中的優(yōu)勢菌株進行分離鑒定，并進行人工感染和藥敏試驗，深入分析文蛤致病菌，為文蛤養(yǎng)殖提供參考依據(jù)，合理用藥，避免更多的損失。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病文蛤 于2016年8月份在山東沿海某文蛤養(yǎng)殖區(qū)域，文蛤發(fā)病高峰期，采集病狀特征明顯、瀕臨死亡的文蛤?；疾∥母?，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分發(fā)病文蛤的腮黏液明顯增多。

1.2 細(xì)菌分離 無菌水沖洗文蛤表面的泥沙，用70%的酒精棉球?qū)w表擦拭消毒，無菌鑷子和剪刀開啟外殼，取肝胰臟等部位無菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線接種，28℃培養(yǎng)12h后，選取優(yōu)勢菌落進行重復(fù)劃線純化，純培養(yǎng)物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染試驗 人工感染試驗在20L水族箱中進行，設(shè)置條件為溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續(xù)充氣。實驗設(shè)置三個試驗組，一個對照組。每組放15只3cm大小的健康文蛤。每天換水1次，試驗組調(diào)節(jié)水體中細(xì)菌濃度為108cfu/ml，每日投單胞藻1次；對照組不加入菌體，按上述方法飼養(yǎng)；連續(xù)觀察12d，紀(jì)錄死亡狀況，并對死亡文蛤進行解剖和病原的再分離，以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 細(xì)菌生化鑒定 按一般細(xì)菌常用鑒定方法進行分離菌的生物學(xué)性狀測定，包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性測定(所用試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.5 16SrDNA克隆、測序 采用細(xì)菌16SrDNA序列擴增的通用引物對純化培養(yǎng)的細(xì)菌16S rDNA序列進行PCR擴增。上游引物為5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游引物為5'AAGGAGGTGWTCCARCC-3'(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程有限公司進行序列測定。

1.6 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法，在TCBS選擇培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)12h，測量抑菌圈直徑。藥敏紙片購自杭州

天和微生物試劑有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)特征 在TCBS弧菌固體選擇培養(yǎng)基上生長，28度溫箱中培養(yǎng)12h，菌落為黃色(圖1)。該菌經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，為革蘭氏陰性菌，菌體短小，長約2～3μm，有的弧菌有一定的彎曲，呈弧狀或逗點狀(圖2)。無芽胞和莢膜。

圖1 細(xì)菌在TCBS培養(yǎng)基上的生長特性

圖2 細(xì)菌革蘭氏染色照片

2.2 人工感染試驗 人工感染2d后，文蛤開始出現(xiàn)病態(tài)，5d后開始出現(xiàn)死亡，10d后試驗組不再出現(xiàn)死亡，病死率為80%。于是初步判定2016年8月山東某養(yǎng)殖區(qū)文蛤大批死亡主要是以該分離菌為主要病原體的傳染病所造成。2.3 分離菌株生化特性 細(xì)菌生化特性結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌生化特性

2.4 16SrDNA克隆、測序 對2-1菌株16S rDNA序列進行進化樹分析PCR擴增，如圖3所示，進一步證實該菌為哈氏弧菌。

圖3 細(xì)菌進化樹分析結(jié)果，圖中2-1.seq表示分離株

2.5 藥物敏感試驗 藥物的敏感性根據(jù)抑菌圈直徑大小來判斷，抑菌圈直徑大于20mm為高度敏感；15.1～20mm為敏感；10.1～15mm為中度敏感；10mm以下為低度敏感；無抑菌圈為耐藥。

表2 藥物抑菌圈直徑 (mm)

根據(jù)試驗結(jié)果顯示，哈氏弧菌對18種藥物有不同程度的耐藥性。對萘定酸、氯霉素表現(xiàn)為高度敏感；環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為敏感；阿米卡星、慶大霉素、多西環(huán)素、頭孢噻吩、頭孢呋辛表現(xiàn)為中度敏感；氨芐西林，阿莫西林表現(xiàn)為耐藥。

3 討論

（1）哈氏弧菌感染海水養(yǎng)殖動物的報道比較多，但導(dǎo)致貝類病害發(fā)生的報道卻很少。本次樣品采集是在高水溫期，表明哈氏弧菌是容易在高溫環(huán)境下生長并導(dǎo)致海水養(yǎng)殖動物的弧菌病，通過人工感染實驗可知，感染后的試驗文蛤出現(xiàn)明顯的病癥：表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現(xiàn)外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分患病文蛤腮黏液明顯增多，死亡率高達80%，從浸泡感染方式發(fā)病文蛤處分離到與自然發(fā)病相同的細(xì)菌，因此可以確定該分離株是文蛤發(fā)病的病原體。（2）從藥敏試驗結(jié)果來看，該菌對萘定酸、氯霉素表現(xiàn)為高度敏感；環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為敏感；阿米卡星、慶大霉素、多西環(huán)素、頭孢噻吩、頭孢呋辛表現(xiàn)為中度敏感；氨芐西林，阿莫西林表現(xiàn)為耐藥。因此在疾病發(fā)生時可以適量投放一些抗菌性藥物，但值得注意的是目前在養(yǎng)殖過程中誤用、濫用抗生素和消毒劑等，影響了水體中微生態(tài)環(huán)境的平衡，可能導(dǎo)致了一些耐藥菌株的出現(xiàn)，但是合理選擇和使用有效的抗生素仍是目前和近期內(nèi)控制疾病主要方法。為了更好的預(yù)防病害發(fā)生，塘養(yǎng)或池養(yǎng)文蛤(灘涂除外)可以適量投放微生態(tài)制劑，如芽孢桿菌和光合細(xì)菌，以達到生態(tài)防治的目的。

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2017–04–13）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貝類創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-14-07）*通訊作者