HPLC法同時測定黃草烏中滇烏堿和草烏甲素的含量

徐怡+秦波+曹紅云+張曉南+劉慧+游燕

摘要：目的建立同時測定黃草烏中滇烏堿和草烏甲素含量的高效液相色譜方法。方法采用Waters XTerra MS C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相為0.025mol/L磷酸二氫鉀溶液（1000ml加1ml磷酸）-乙腈：四氫呋喃（25：15）為流動相梯度洗脫，流速1 ml/min，柱溫 30℃；檢測波長260nm。結(jié)果滇烏堿和草烏甲素分別在5.27～421.6μg/ml、5.02～401.6μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.7%～104.3%、96.8%～99.3%，RSD分別為1.34%、0.82%。結(jié)論經(jīng)方法學(xué)驗證，本法可用于同時測定黃草烏中滇烏堿、草烏甲素的含量，為該藥材的質(zhì)量控制和臨床用藥安全提供了有力的分析手段。

關(guān)鍵詞：黃草烏；滇烏堿；草烏甲素；高效液相色譜法

中圖分類號：R927.2文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）09-0070-03

黃草烏Aconitum vilmorr-ianum Kom.毛茛科植物的塊根。主要含有滇烏堿、草烏甲素，二者均具有鎮(zhèn)痛抗炎藥理活性，滇烏堿的毒性最強，草烏甲素次之。因此本試驗采用高效液相色譜法同時測定黃草烏中的2種主要二萜類生物堿的含量，為黃草烏藥材的質(zhì)量控制和臨床用藥安全提供參考，也為進一步合理開發(fā)草烏甲素原料植物資源提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器及試劑美國Agilent1100高效液相色譜儀（四元泵、DAD檢測器、自動進樣器、在線真空脫氣機、智能化柱溫箱及Agilent化學(xué)工作站）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TC-6 KA型電子天平；DFY-500型粉碎機；SK-3200LH型超聲清洗儀（功率250W，頻率59KH）；乙腈（色譜純，默克公司）、四氫呋喃（色譜純，默克公司）；其余為分析純；水為自制超純水。

1.2試藥黃草烏藥材購自昆明菊花園中藥材市場，其產(chǎn)地為昭通，經(jīng)云南省藥物所究所天然藥物資源研究中心正高級工程師高麗鑒定經(jīng)鑒定系毛茛科植物黃草烏Aconitum vilmorrianum Kom.的干燥塊根。草烏甲素對照品（中國食品藥品生物檢定所，純度≥98%），滇烏堿為本實驗室自制，經(jīng)純度測定，其純度為98.1%。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱Waters XTerra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液（每1000 mL加磷酸1ml）為流動相A，乙腈：四氫呋喃（25：15）為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長：260 nm；進樣量10 μL。見表1。

2.2對照品溶液制備取滇烏堿對照品和草烏甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含100μg的混合溶液，即得。見圖1。

2.3供試品溶液制備精密稱取黃草烏藥材（過三號篩）約5 g，置具塞錐形瓶中，加5%鹽酸5 mL，精密加入甲醇-異丙醇（1：1）50 mL，稱定重量，密塞，超聲處理（功率250W，頻率59KH）30 min，放冷，再稱量，用甲醇-異丙醇（1：1）補足減失的量，搖勻，濾過，濾液用氨水調(diào)節(jié)至中性。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密量取混合對照品貯備液（滇烏堿：421.6 μg/mL、草烏甲素：401.6 μg/mL），分別用甲醇稀釋成滇烏堿：421.6、210.8、105.4、84.32、42.16、21.08、10.54、5.27 μg/mL，草烏甲素：401.6、200.8、100.4、80.32、40.16、20.08、10.04、5.02 ug/mL的對照品溶液，照確定的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以含量及相應(yīng)峰面積得線性方程和相關(guān)系數(shù)。見表2，圖2～3。

線性方程：Y=1603.5X+0.5324，r=0.9999，滇烏堿在5.27～421.6 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

線性方程：Y=1608.7X+7.7093，r=0.9999，草烏甲素在5.02～401.6 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察取同一混合對照品溶液（滇烏堿105.45 μg/mL、草烏甲素100.35 μg/mL），按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次，峰面積RSD分別為1.32%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取已制備好的供試品溶液按“2.1”項色譜條件，分別于0、6、8、12、24 h進樣，進樣體積10μl，以峰面積計算，結(jié)果RSD=1.2%（n=5），所得的樣品中滇烏堿、草烏甲素含量基本一致，說明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗精密稱取黃草烏藥材6份，按照“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，測定滇烏堿和草烏甲素含量，測得滇烏堿和草烏甲素平均含量分別為187.13 μg/g，58.76 μg/g，RSD分別為0.98%、1.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗取已知含量的黃草烏藥材（滇烏堿：187.13 μg/g和草烏甲素：58.76 μg/g）9份，每份2.5 g，精密稱定，以1：0.5，1：1，1：1.5分別精密加入對照品，按“2.3”項供試品溶液制備方法制備，測定滇烏堿和草烏甲素含量，計算回收率，回收率分別為99.7%～104.3%、96.8%～99.3%；RSD分別為1.34%、0.82%。表明該方法準確度較好。

2.9耐用性試驗

2.9.1不同色譜柱考察選用不同品牌的3根色譜柱：Waters XTerra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），WatersSymmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Shiseido MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（日本 資生堂），對供試品溶液和標準品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果3根色譜柱保留時間與峰形略有差異，但滇烏堿和草烏甲素的峰都能完全分離，分離度均達到1.5以上，且所測得的滇烏堿和草烏甲素含量只是略有差異。表明色譜柱型號對檢測結(jié)果影響不大。endprint

2.9.2柱溫變化考察改變柱溫，其他條件不變，按“2.1”項下色譜條件進樣測定供試品溶液，記錄色譜圖，結(jié)果表明柱溫在20℃～40℃變動時，測定結(jié)果影響不大。

2.9.3不同色譜儀考察選用不同品牌的3臺高效液相色譜儀：Agilent 1100，Waters 2695，Shimadzu LC 2010，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明在儀器的品牌、型號有變動時，對照品的峰能夠完全分離，且進樣濃度有小的波動時，測定結(jié)果影響不大，在儀器穩(wěn)定的情況下，仍可以準確進行定量測定。

2.10樣品測定取不同批次的樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄各成分的峰面積，以外標法計算樣品中各成分的含量。見表4。

3討論

試驗中的黃草烏中均含有滇烏堿。部分不含草烏甲素，可能與藥材的產(chǎn)地和生長年限相關(guān)。二者均為二萜類生物堿，由于這類成分本身具有較強的藥理活性和毒性，因此，對其精確地控制尤為重要。本研究不僅為黃草烏的質(zhì)量標準研究奠定基礎(chǔ)，也為精確控制云南產(chǎn)草烏類藥材的安全性和有效性提供依據(jù)。

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