王占龍，封凱

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010)

甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR、NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

王占龍，封凱

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010)

目的探討甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中促甲狀腺激素受體(TSHR)與鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系。方法收集80例PTC患者臨床資料及手術(shù)病理標(biāo)本石蠟切片，采用實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR(qMSP)法檢測(cè)TSHR和NIS啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，分析二者與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為71.25%、32.50%，癌旁正常組織中分別為8.75%、6.25%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；不同年齡、性別、腫瘤直徑PTC患者癌組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，病灶多發(fā)、腺外侵犯、有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期PTC患者癌組織中TSHR與NIS甲基化程度高于病灶單發(fā)、局限腺內(nèi)、無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期Ⅰ～Ⅱ期者(P均<0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示，PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化呈正相關(guān)(r=0.532，P<0.05)。結(jié)論P(yáng)TC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化現(xiàn)象普遍存在，與病灶多發(fā)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯、臨床分期關(guān)系密切，兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化協(xié)同作用可能是引起腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制之一。

甲狀腺乳頭狀癌；促甲狀腺激素受體；鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體；啟動(dòng)子；甲基化；病理特征

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，也是世界上發(fā)病率增速較快的惡性腫瘤之一[1～3]，在我國(guó)腫瘤發(fā)病率中位居第10位。根據(jù)組織學(xué)類(lèi)型和細(xì)胞來(lái)源等特征，甲狀腺癌可分為甲狀腺濾泡狀癌(FTC)、甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺低分化型癌(PDTC)、甲狀腺未分化癌(ATC)。其中，PTC最為常見(jiàn)，占到80%左右，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。但是，臨床相關(guān)研究顯示促甲狀腺激素受體(TSHR)與鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)與甲狀腺癌的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[4～7]。TSHR是甲狀腺特異蛋白，與TSH結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)碘代謝的調(diào)節(jié)作用。本研究對(duì)PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了研究，旨在分析二者在PTC發(fā)病中所起的作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后經(jīng)病理確診為原發(fā)性PTC；②術(shù)前未行放療、化療等治療；③未合并其他惡性腫瘤；④患者臨床資料完整，手術(shù)病理標(biāo)本石蠟切片完整。收集2011年1月～2016年6月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行甲狀腺癌根治術(shù)的80例PTC患者，男12例，女68例；年齡(46.98±4.10)歲，其中≤45歲46例、>45歲34例；單發(fā)病灶46例，多發(fā)病灶34例；腫瘤直徑≤2 cm 57例，腫瘤直徑>2 cm 23例； 腺外侵犯36例，局限腺內(nèi)44例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(包括氣管前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期28例。

1.2 TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)方法

1.2.1 DNA提取 每例患者選取3～5張病理標(biāo)本石蠟切片，包括癌組織及癌旁開(kāi)3 mm之外的正常組織；進(jìn)行蘇木精及伊紅染色、洗滌，在37 ℃下溫箱內(nèi)干燥過(guò)夜。100%的二甲苯溶液進(jìn)行脫蠟15～30 min，循環(huán)5次；采用100%、85%的乙醇溶液梯度洗脫15 min，再用ddH2O水化處理10 min；在顯微鏡下觀察及尋找癌細(xì)胞及癌旁正常細(xì)胞，獲取約4 000個(gè)目標(biāo)細(xì)胞；以DNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取DNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 甲基化測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR(qMSP)法。以DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(Qiagen公司)對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鈉修飾及純化回收，參考文獻(xiàn)[8]根據(jù)TSHR和NIS基因序列設(shè)計(jì)CpG島特異甲基化和非甲基化引物；采用ABI 7500PCR儀對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行分析，根據(jù)測(cè)得的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DNA甲基化百分率(M%)。M%=甲基化DNA拷貝數(shù)/(甲基化DNA拷貝數(shù)+非甲基化DNA拷貝數(shù))×100%，M%>20.00%為甲基化，其中>80%為完全甲基化、20%～80%為部分甲基化、<20%為非甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織與癌旁正常組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況比較 PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為71.25%(57/80)、32.50%(26/80)，癌旁正常組織中分別為8.75%(7/80)、6.25%(5/80)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與PTC臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別、腫瘤直徑PTC患者癌組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);病灶多發(fā)、腺外侵犯、有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期PTC患者癌組織中TSHR與NIS甲基化程度高于病灶單發(fā)、局限腺內(nèi)、無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期Ⅰ～Ⅱ期者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與PTC臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化呈正相關(guān)(r=0.532，P<0.05)。

3 討論

PTC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與激素作用、基因改變、環(huán)境影響等有關(guān)[1～3,9]。其中，研究明確的PTC相關(guān)的分子事件有轉(zhuǎn)染重排基因/PTC基因的重排、碘代謝相關(guān)基因TSHR和NIS啟動(dòng)子的異常甲基化、v-raf鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性病毒致癌基因同源體B1的V600E點(diǎn)突變及miR-31、miR-222等異常表達(dá)[8]。

TSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，定位在14q13，主要表達(dá)在甲狀腺濾泡細(xì)胞基底外側(cè)膜上[10～13]，可與其配體TSH結(jié)合，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)及分化，促進(jìn)甲狀腺素合成，可直接促進(jìn)甲狀腺組織對(duì)碘的攝取。NIS主要分布在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的基底膜，可通過(guò)鈉鉀離子交換形成的濃度梯度來(lái)將細(xì)胞外血液中的碘離子從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到甲狀腺濾泡細(xì)胞中，是限制甲狀腺激素合成的主要影響機(jī)制[14～16]，定位在19p13。臨床研究[8]發(fā)現(xiàn)，DNA啟動(dòng)子區(qū)CPG島的異常甲基化是引起TSHR與NIS基因失活的最常見(jiàn)原因，在甲狀腺癌組織中均存在TSHR與NIS基因的甲基化失活現(xiàn)象，TSHR與NIS基因的甲基化參與了甲狀腺癌的早期癌變過(guò)程。有研究[8]顯示，TSHR甲基化的發(fā)生可能是由于TSHR蛋白表達(dá)減弱導(dǎo)致，這種表達(dá)異?？赡苁怯捎贐RAF基因突變所致。TSHR蛋白表達(dá)異常使得甲狀腺組織攝取碘的功能發(fā)生異常，可能引起組織發(fā)生癌變及惡性程度的增加。甲狀腺細(xì)胞中的TSHR可與部分蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)行支持信號(hào)的傳導(dǎo)，如鈣連接蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、纖連蛋白等，這些蛋白基因突變可對(duì)信號(hào)通路形成異常影響。NIS負(fù)責(zé)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞及癌細(xì)胞的碘攝取，出現(xiàn)失活可引起甲狀腺癌的發(fā)生及病程進(jìn)展。其功能失活的可能機(jī)制是NIS蛋白和mRNA表達(dá)絕對(duì)量的下調(diào)和表達(dá)絕對(duì)量的升高引起細(xì)胞膜到細(xì)胞質(zhì)的異位，最終影響到碘的攝取。

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)惡性腫瘤的侵襲性進(jìn)行準(zhǔn)確判斷是選取手術(shù)治療的關(guān)鍵，如能明確惡性腫瘤的侵襲性高低，可避免不加選擇的對(duì)惡性腫瘤患者進(jìn)行“過(guò)度治療”現(xiàn)象，如何選取合適的“腫瘤標(biāo)記物”在術(shù)前對(duì)腫瘤惡性程度及侵襲性進(jìn)行判斷，值得關(guān)注。高侵襲性的甲狀腺癌一般存在局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和多發(fā)病灶等表現(xiàn)，同時(shí)進(jìn)展較快。有研究顯示,TSHR與NIS基因的甲基化程度可反映出PTC的侵襲性[17,18]，為甲狀腺癌的診斷和治療提供參考。本研究對(duì)PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的發(fā)生率高于癌旁正常組織，提示TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化確實(shí)與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生有關(guān)。在正常甲狀腺組織中，TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化現(xiàn)象并不嚴(yán)重，但是也有甲基化現(xiàn)象。分析PTC患者臨床病理特征與TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的關(guān)系，結(jié)果顯示患者年齡、性別、腫瘤直徑不同時(shí)TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率無(wú)明顯差異性，但是病灶多發(fā)、有腺外侵犯、有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期時(shí)甲基化發(fā)生率高于無(wú)以上狀況者，而以上現(xiàn)象均提示患者腫瘤細(xì)胞侵襲性較強(qiáng)。因此，TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與PTC患者病情關(guān)系密切，也可能是引起腫瘤侵襲的可能機(jī)制之一。分析TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PTC組織中二者呈正相性，說(shuō)明以上兩種基因的甲基化可能是平行存在的。陸曉筱等[8]研究也顯示，PTC組織中hMLH1、NIS和TSHR基因異常甲基化是普遍存在的，但他們之間不存在相關(guān)性，是獨(dú)立、協(xié)同的對(duì)PTC的進(jìn)展進(jìn)行了影響。

綜上所述，PTC組織中TSHR與NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化現(xiàn)象普遍存在，與病灶多發(fā)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯、臨床分期關(guān)系密切，兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化協(xié)同作用可能是引起腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制之一。

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B

1002-266X(2017)34-0083-03

2017-02-03)

封凱(E-mail: sunny_1806@126.com)