龐敏　黃科　劉奕清

摘要：分別采用細(xì)菌16S rRNA、真菌rDNA-ITS通用引物對(duì)藍(lán)莓莖尖脫毒苗基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，細(xì)菌16S rRNA、真菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；Trizol提取藍(lán)莓莖尖脫毒苗RNA用于病毒衣殼蛋白基因擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性；莖尖脫毒藍(lán)莓經(jīng)離體快繁，增殖系數(shù)可達(dá)5。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；莖尖脫毒；擴(kuò)增；繁殖系數(shù)

中圖分類號(hào)： S663.904+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0031-03

藍(lán)莓為杜鵑花科藍(lán)莓屬（Vaccinium spp.） 小灌木水果，因所含花青素生理活性好于其他植物且具特色保健功能而風(fēng)靡全球。我國從20世紀(jì)80年代開始引種栽培藍(lán)莓，由于其病害發(fā)生率高且嚴(yán)重而導(dǎo)致減產(chǎn)[1]。引起藍(lán)莓發(fā)病主要的真菌性病原有葡萄座腔菌科真菌Neofusicoccum parvum 和N. austral、細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、炭疽病菌 （Colletotrichum）、棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）等[2-6]，能引起藍(lán)莓葉片或枝條發(fā)病，使藍(lán)莓葉片出現(xiàn)不規(guī)則壞死斑點(diǎn)，斑點(diǎn)邊緣為棕褐色、棕紅色或黑色，枝頂芽枯萎、死亡或主干枯萎等；藍(lán)莓主要病毒病害有藍(lán)莓枯焦病毒（blueberry scorch virus，BLScV）、藍(lán)莓急性壞死病毒（blueberry shock virus，BLShV）[7]。另外，藍(lán)莓還受藍(lán)莓根瘤病的危害[8]。

傳統(tǒng)的藍(lán)莓繁育方式為分株、扦插等，不僅耗時(shí)、耗工，而且種苗不均一、攜帶病原，而通過植物分生組織或愈傷組織育苗可去除植物中已感染的病毒[9]。因此，本研究建立藍(lán)莓莖尖脫毒繁育技術(shù)，一方面可去除其致病病原物，另一方面可為藍(lán)莓生產(chǎn)提供“種源可靠，數(shù)量充足”的良種，以滿足藍(lán)莓迅猛發(fā)展之需。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

“夏普藍(lán)”（sharpblue）藍(lán)莓，由重慶市天沛農(nóng)業(yè)科技有限公司種質(zhì)資源圃提供，選取2012年春季新生無病蟲害、生長健壯的幼嫩新梢作為外植體。植物激素玉米素（Zeatin，ZT），購自Sigama化學(xué)試劑中國代理公司；DNA聚合酶，購于 Promega 公司；DNA基因組試劑盒，購于Omega公司；擴(kuò)增引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2外植體的誘導(dǎo)

將采集到的外植體剪除葉片，剪成5～6 cm莖段，用清水洗凈；超凈工作臺(tái)上用0.1% HgCl2溶液消毒3 min，置于無菌水中浸泡3～5 min，用無菌水清洗3～5次；切成帶1～2個(gè)葉腋的莖段，接種于添加3 mg/L ZT的CQWL培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃，光照度30～50 μmol/（m2·s）、光照10 h/d；誘導(dǎo)幼芽連續(xù)培養(yǎng)2代，每代時(shí)間約為30 d，轉(zhuǎn)至添加1.5 mg/L ZT的CQWL培養(yǎng)基上，每瓶接種無菌芽6株，連續(xù)繼代培養(yǎng)3代。

1.3莖尖剝離與增殖

將叢生不定芽從基部單個(gè)分離，并自芽基部以上0.5 cm左右處切斷；解剖鏡下用無菌解剖刀小心逐層剝離外層葉鞘，直至露出長0.3～0.5 mm的莖尖；用未使用過的無菌解剖刀將莖尖從母體材料上切下，立即接種于莖尖伸長誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，（25±1） ℃、光照強(qiáng)度10～20 μmol/（m2·s）、光照 12 h/d 條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 將獲得的不定芽接種到添加 1.5 mg/L[KG*2/3]ZT的CQWL培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。經(jīng)3次檢測(cè)的脫毒藍(lán)莓苗按同樣方法進(jìn)行增殖。

1.4再生植株RT-PCR快速檢測(cè)

1.4.1脫細(xì)菌與真菌檢測(cè)利用DNA基因組試劑盒提取經(jīng)莖尖脫毒的藍(lán)莓組培苗及培養(yǎng)基中可能存在的細(xì)菌基因組DNA。稱取0.3 g組培苗的根，液氮研磨，將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)熱A液，渦旋振蕩器振蕩，稱取0.3 g培養(yǎng)基于預(yù)熱A液中充分溶化，65 ℃水浴至少5 min；13 000 r/min離心5 min；取 350 μL 上清液至離心管中，加入等體積的溶液B充分混勻，冰浴 5 min，13 000 r/min室溫離心5 min；上清液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，加入200 μL氯仿，振蕩30 s，13 000 r/min室溫離心5 min；上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，混勻，15 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌，干燥，產(chǎn)物加入20 μL TE緩沖液溶解。

采用16S rRNA通用引物F：5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′、R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[10]，以提取物為基因組DNA模板，進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增；采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITS1：5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′、ITS2：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[6]對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：ddH2O 17.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，引物各0.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，Taq酶 0.5 μL，總DNA 1 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.4.2脫病毒檢測(cè)分別取0.5 g藍(lán)莓組培苗的根和莖段，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末狀；轉(zhuǎn)移至1.5 mL無核糖核酸內(nèi)切酶（RNase）的離心管中，按0.1 g組織樣品加入1 000 μL TRIzol的量添加Trizol，充分搖勻，室溫放置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；取上清液至 1.5 mL 離心管，加氯仿200 μL，輕輕搖勻，靜置5 min，10 000 r/min、4 ℃ 離心10 min；取上清液至1.5 mL離心管，加2倍體積異丙醇，輕輕搖勻，靜置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清液，加75%乙醇1 000 μL，洗滌提取物，干燥；用50 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解提取物，電泳檢測(cè)。分別用藍(lán)莓枯焦病毒衣殼蛋白基因V1：5′-TGTGTC AAACAATATGGC-3′、V2：5′-GCATTTCGATGATTGCGG-3′[11]，藍(lán)莓急性壞死病毒衣殼蛋白基因（GenBank：KF031042.1）設(shè)計(jì)引物V3：5′-ATGACGTCAATGGCTTCCGCAC-3′、V4：5′-CTAACCTAACGTGCTTGAAGTTC-3′ 和反轉(zhuǎn)錄cDNA模板進(jìn)行病毒衣殼蛋白基因擴(kuò)增；5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。endprint

2結(jié)果與分析

2.1藍(lán)莓外植體的誘導(dǎo)增殖

經(jīng)CQWL+3.0 mg/L ZT培養(yǎng)基誘導(dǎo)1周，藍(lán)莓幼芽開始啟動(dòng)（圖1-A）；經(jīng)30 d繼代培養(yǎng)，藍(lán)莓幼芽誘導(dǎo)率為432%；經(jīng)培養(yǎng)3代，藍(lán)莓出現(xiàn)叢生芽、頂芽生長，新梢健壯有活力（圖1-B），此時(shí)增殖系數(shù)約為3。

2.2莖尖剝離與增殖

顯微鏡下將頂芽剝?yōu)?.3～0.5 mm的莖尖，并插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（圖2-A）誘導(dǎo)培養(yǎng)4周，藍(lán)莓莖尖不形成愈傷組織，而是直接發(fā)育成完整植株，新生頂芽長勢(shì)較快，形成3個(gè)莖段新梢，葉片墨綠（圖2-B）。

2.3藍(lán)莓莖尖RT-PCR快速檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果表明，以莖尖脫毒藍(lán)莓組培種苗的根和固體培養(yǎng)基為混合物提取的基因組DNA作為模板，不能擴(kuò)增出16S rRNA，而大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組能擴(kuò)增出16S rRNA，即莖尖繁殖不含致病的細(xì)菌（圖3-A）；以莖尖脫毒藍(lán)莓組培種苗的根和固體培養(yǎng)基為混合物提取的基因組DNA作為模板，不能擴(kuò)增出rDNA- ITS序列，即莖尖繁殖不含致病的真菌（圖3-B）；莖尖脫毒苗中不含藍(lán)莓枯焦病毒和急性壞死病毒（圖3-C）。

2.4藍(lán)莓莖尖脫毒的增殖繁育

由圖4可見，莖尖脫毒材料經(jīng)3代連續(xù)培養(yǎng)，植株健壯，葉片綠色，頂芽直立生長，側(cè)芽萌發(fā)伸長；植株發(fā)育正常，增殖系數(shù)可達(dá)5。

3結(jié)論與討論

目前，植物病毒及細(xì)菌的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)及電鏡技術(shù)[12-13]。生物學(xué)檢測(cè)簡(jiǎn)單、靈敏，僅需將少許宿主接種到指示植物即可，但缺點(diǎn)是受病毒滴度、環(huán)境、時(shí)間限制，病原確定的周期相對(duì)較長。以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，且在宿主發(fā)病早期即能檢測(cè)病原，已在馬鈴薯、甘薯、柑橘等病毒檢測(cè)[14-16]中廣泛應(yīng)用。本研究利用PCR技術(shù)，對(duì)莖尖脫毒的藍(lán)莓種苗及培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA檢測(cè)，結(jié)果表明，莖尖脫毒藍(lán)莓和培養(yǎng)基混合基因組不能擴(kuò)增出16S rRNA，而大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌菌株基因組能擴(kuò)增出16S rRNA，說明利用脫毒組培技術(shù)培養(yǎng)的莖尖種苗不含細(xì)菌。對(duì)真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)擴(kuò)增結(jié)果為陰性，結(jié)果表明，莖尖脫毒藍(lán)莓不含真菌病原；參照RNA提取步驟，用Trizol試劑提取莖尖脫毒藍(lán)莓苗莖段的RNA，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)無目的條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性，這說明莖尖脫毒藍(lán)莓有可能完全脫毒。因此，以此為依據(jù)建立的藍(lán)莓良種莖尖脫毒技術(shù)可用于藍(lán)莓的離體快繁。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊燕林，和志嬌，王朝文，等. 云南藍(lán)莓病蟲害調(diào)查及防治方法[J]. 植物保護(hù)，2014，40（4）：153-156，197.

[2]余磊，趙建榮，Impaprasert R，等. 藍(lán)莓枝枯病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2013，43（4）：421-425.

[3]嚴(yán)雪瑞，周源，趙睿杰，等. 藍(lán)莓葉穿孔病菌鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 北方園藝，2014（16）：123-127.

[4]Liu Y H，Lin T，Ye C S，et al. First report of Fusarium wilt in blueberry （Vaccinium corymbosum） caused by Fusarium oxysporum in China[J]. Plant Disease，2014，98（8）：1158.[HJ1.7mm]

[5]徐成楠，王亞南，胡同樂，等. 藍(lán)莓炭疽病病原菌鑒定及致病性測(cè)定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（20）：3992-3998.

[6]趙洪海，岳清華，梁晨. 藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病的病原菌[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2014，33（3）：577-583.

[7]Martin R R，Bristow P R，Wegener L A. Scorch and shock：emerging virus diseases of highbush blueberry and other Vaccinium species[J]. Acta Horticulturae，2006（715）：463-467.

[8]傅俊范，彭超，嚴(yán)雪瑞，等. 藍(lán)莓根癌病發(fā)生調(diào)查及病原鑒定[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（3）：283-286，292.

[9]Wang P J. Hu C Y. Regeneration of virus-free plants through in vitro culture[J]. Advances in Biochemical Engineering，1980，18：61-99.

[10]Song J，Lee S C，Kang J W，et al. Phylogenetic analysis of Streptomyces spp. isolated from potato scab lesions in Korea on the basis of 16S rRNA gene and 16S-23S rDNA internally transcribed spacer sequences[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54（1）：203-209.

[11]Demarsay A，Hillman B I，Petersen F P，et al. First report of blueberry scorch virus on highbush blueberry in Connecticut and Massachusetts[J]. Plant Disease，2004，88（5）：572.

[12]劉健，張德詠，張松柏，等. 湖南和福建辣椒上辣椒脈斑駁病毒的檢測(cè)及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：184-185.

[13]曹冬梅，李鑫，孫曉菲，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒試紙條的研制[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：152-154.

[14]羅文彬，李華偉，湯浩，等. 馬鈴薯5種病毒多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2015，42（2）：280-288.

[15]李懷情，牛力立，趙佐敏，等. 紫云甘薯組培脫毒及離體快繁技術(shù)研究[J]. 種子，2014，33（10）：131-132，134.

[16]陶珍珍，李中安，賈敏，等. T3基因型柑橘衰退病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2015，42（1）：183-190.endprint