管菊　萬勁　陳嘉裔

摘要：以白牡丹葉片及幼嫩莖段為外植體，建立無菌快繁體系，在此基礎(chǔ)上篩選適合白牡丹組培快繁不同生長階段的最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明：最適宜的外植體材料為葉片，滅菌方法為75%乙醇處理15 s、0.1% HgCl2處理12 min；最佳的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，芽誘導(dǎo)量可達10.8個/張；最適增殖培養(yǎng)基為 MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+1 mg/L KT，增殖倍數(shù)可達11.57；使用切根苗于干燥基質(zhì)上進行生根煉苗可取得較好效果，煉苗成活率可達95%。

關(guān)鍵詞：多肉植物；白牡丹；組織培養(yǎng)

中圖分類號： S682.330.4+3文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0036-03

白牡丹（Graptoveria ‘Titubans）由景天科石蓮花屬多肉植物靜夜（Echeveria derenbergii）與風(fēng)車草屬朧月（Graptopetalum paraguayense）雜交培育而來，是目前較為流行的多肉園藝品種之一。白牡丹莖葉肉質(zhì)化，全株被白粉，互生葉排列成蓮座形，如牡丹花綻放，具有很高的觀賞價值[1]。白牡丹繁殖方式目前僅局限于扦插以及分株繁殖，白牡丹規(guī)模繁殖一直存在技術(shù)瓶頸。因此，對于白牡丹組培快繁技術(shù)進行研究具有一定意義，本研究將為白牡丹組培擴繁提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為西南林業(yè)大學(xué)大棚內(nèi)種植的多肉植物白牡丹。選取的外植體分別為白牡丹植株的葉片、莖段。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)條件本試驗采用MS為基本培養(yǎng)基，附加 0.4% 1 500 g/cm2強度卡拉膠、30 g/L蔗糖，pH值調(diào)節(jié)至 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min備用。選用日本三洋MLR-351H型培養(yǎng)箱進行組織培養(yǎng)，光照度設(shè)定為 3 000 lx，設(shè)定每天的光照時間為18 h，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2.2材料與消毒選取長勢良好的植株莖段與葉片為供試材料。葉片要求為從基部與莖段分離的完整葉片，葉片飽滿挺拔、表面無傷痕；莖段要求為當(dāng)年生幼嫩莖段，表面無傷痕、無蟲害。剪取材料后，將材料首先置于洗衣粉中浸泡約10 min，在浸泡過程中，用軟毛刷輕輕刷洗，將材料表面殘留的污物清除；之后再將材料置于流水中沖洗，沖洗約3 h，沖洗完成后，將材料置于超凈臺內(nèi)，用75%乙醇快速浸泡15 s；取出后立即置于無菌水中清洗，再用0.1% HgCl2消毒，設(shè)置4、8、12、16 min 4個時間梯度的消毒處理，之后用無菌水清洗 5～6次，總清洗時間不少于15 min；將清洗后的材料置于滅菌濾紙上吸去多余水分，接種入MS空白培養(yǎng)基中，每瓶接種1株，每個處理20瓶，3次重復(fù)。3 d后開始記錄污染率、污染類型、死亡率，之后每天記錄1次，15 d后結(jié)束記錄。

1.2.3誘導(dǎo)培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加不同含量的NAA、6-BA（表1），使用之前試驗中所得的最適外植體材料以及最適消毒方法，將外植體接種于分別附加不同激素含量的培養(yǎng)基中，每種處理接20瓶，每瓶接種1株，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)情況。

1.2.4增殖培養(yǎng)根據(jù)初代培養(yǎng)中白牡丹無菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)的長勢情況，確定白牡丹無菌苗的增殖培養(yǎng)方式。將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)得到的白牡丹叢生芽或愈傷組織接種于以MS為基本培養(yǎng)基，分別附加不同含量NAA、6-BA、KT的培養(yǎng)基中，進行增殖培養(yǎng)，采用L9（34）正交試驗設(shè)計（表2、表3），每種處理接20瓶，每瓶接種3株，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計增殖情況。

1.2.5生根培養(yǎng)與煉苗移栽采用1/2MS培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，當(dāng)植株長至4～5 cm時進行煉苗移栽。煉苗基質(zhì)采用椰糠+珍珠巖以1 ∶[KG-*3]1體積比例混配，121 ℃高壓蒸汽滅菌對基質(zhì)進行消毒。由于景天科植物生根較為容易，故分別選取未經(jīng)生根培養(yǎng)、經(jīng)過生根培養(yǎng)且根長為4～5 cm的2種材料進行煉苗培養(yǎng)。先將瓶口打開，逐漸與外界環(huán)境接觸，提高種苗的適應(yīng)能力，5 d后將小苗取出，在自來水下用鑷子、軟毛刷等洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，種于含水量不同的基質(zhì)中（表4），每個處理接種20株苗，3次重復(fù)，保持空氣濕度在70%以上，30 d后統(tǒng)計成活率及根系情況。

2結(jié)果與分析

2.1不同植物器官及不同HgCl2消毒時間對外植體成活率的影響

表5顯示，隨著HgCl2消毒時間的增加，污染率大幅度降低，這說明使用HgCl2處理對材料表面所攜帶的污染物具有較好的滅殺效果；但是隨著HgCl2處理時間的延長，植物成活率明顯降低，說明過長時間的HgCl2接觸會對白牡丹外植體造成較大傷害。

不同植物器官用HgCl2處理的效果也是不同的，使用莖段作為外植體時，大部分處理成活率要低于以葉片為外植體的處理組，這說明相比莖段，葉片更適宜作為外植體。同時，使用莖段作外植體時，3 d后的污染率仍然在不斷上升，與 15 d 時相比，各處理的污染率上升幅度均大于以葉片為外植體的處理組，這一現(xiàn)象可能與莖段上存在滅菌死角、自身所帶的內(nèi)生菌較多有關(guān)，也進一步說明了相比莖段，葉片更適宜作為外植體。

綜合白牡丹生長特性，由于白牡丹自身生長速度緩慢，難以取得如花莖這類內(nèi)生菌相對較少的外植體材料，故較適的外植體材料為葉片，最佳消毒處理方法為采用75%乙醇處理15 s、0.1% HgCl2處理12 min。

2.2不同培養(yǎng)基下無菌苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)

表6顯示：使用白牡丹葉片為外植體，在合適培養(yǎng)基配方下葉片即可以直接誘導(dǎo)出大量叢生芽。在試驗中發(fā)現(xiàn)，NAA與6-BA含量比值與叢生芽的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，6-BA含量范圍為1～3 mg/L時，當(dāng)6-BA/NAA值<10，則大部分葉片開始只生根不長芽，最終葉片死亡；當(dāng)6-BA/NAA>10時，大部分葉片逐漸開始發(fā)生膨大，最終形成水漬狀的愈傷組織；6-BA/NAA值=10時，叢生芽誘導(dǎo)效果最好。當(dāng)6-BA含量為2 mg/L、NAA含量為0.2 mg/L時，白牡丹叢生芽誘導(dǎo)效果最好，在滅菌接種約8 d時，葉片首先出現(xiàn)一定膨大，部分區(qū)域發(fā)生開裂，可見內(nèi)部嫩綠色膨大組織；之后15 d左右時，在近基部的葉片區(qū)域以及葉片開裂的區(qū)域內(nèi)，萌發(fā)出大量叢生芽，叢生芽平均萌發(fā)量達10.8芽/張，誘導(dǎo)效果良好。endprint

2.3不同培養(yǎng)基下無菌苗的增殖培養(yǎng)

由表7可見，第3組處理2 mg/L 6-BA+2 mg/L KT的增殖倍數(shù)最高，但增殖長勢最差，出現(xiàn)了嚴重的玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致之后無法正常繼代生長，故此配方不具備可行性；而在第1組不添加激素的培養(yǎng)基中，叢生芽長勢最好，說明此培養(yǎng)基適合作為白牡丹的壯苗培養(yǎng)基使用，在出現(xiàn)叢生芽長勢變差、需要壯苗生根時，可選用此配方。綜合各組增殖倍數(shù)以及長勢來看，第9組0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA +1 mg/L KT為最佳增殖培養(yǎng)基處理，在此激素組合下叢生芽有較高的增殖倍數(shù)，在長勢上也較為良好，利于轉(zhuǎn)接繼代。

由表8可以看出，KT、6-BA在0.05水平下影響顯著，說明這2種激素在叢生芽增殖時與增殖倍數(shù)有著較大相關(guān)性，而KT影響度相較于6-BA更大，說明KT對于白牡丹叢生芽的增殖倍數(shù)較6-BA更為敏感。NAA對叢生芽增殖倍數(shù)影響較小，結(jié)合叢生芽增殖長勢，NAA含量可能與維持叢生芽正常形態(tài)有關(guān)，通過配合NAA的添加，使得叢生芽在高速增殖的同時仍然保持一定的正常長勢，避免出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

2.4煉苗移栽

白牡丹的煉苗與常規(guī)組培苗煉苗區(qū)別較大。首先，組培苗所產(chǎn)生的根系在煉苗過程中難以存活，這表明在白牡丹快繁過程中不宜進行瓶內(nèi)生根。此外，在白牡丹的煉苗過程中進行保濕處理并不利于其生長，而相對干燥的環(huán)境更加利于白牡丹新根的萌發(fā)及存活。組培苗切根后移栽于保持濕潤的介質(zhì)中，大部分植株在8 d左右時切口處即發(fā)生潰爛，導(dǎo)致植株死亡。由表9可見，帶根的組培苗在保持濕潤的介質(zhì)中始終無明顯變化，30 d內(nèi)未見新根形成，且有部分組培苗出現(xiàn)潰爛死亡。帶根的組培苗移栽于干燥介質(zhì)中，雖然根系很快出現(xiàn)死亡，植株出現(xiàn)了萎蔫現(xiàn)象，但大部分植株在25 d左右后即出現(xiàn)了新根并存活下來，只有少部分植株死亡。將組培苗切根后移栽入保持干燥的介質(zhì)中，相比以上幾組植株成活情況好，植株移栽后在12 d時即見新根產(chǎn)生，煉苗成活率可達95%。

3結(jié)論與討論

不同多肉植物，根據(jù)自身特性的不同，可以用不同的誘導(dǎo)方式以及增殖手法來進行組培擴繁。在實際操作中，需要視無菌苗生長情況進行科學(xué)選擇，如大和錦、玉露、十二卷、壽等這些多肉，首先需要通過誘導(dǎo)形成綠色球狀小體或愈傷組織，再來誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽[2]。本試驗中的白牡丹，在對葉片進行誘導(dǎo)時直接就可以誘導(dǎo)出叢生芽，通過對叢生芽的增殖培養(yǎng)，即可獲得高效增殖擴繁體系，若對其進行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)反而影響了其增殖進程，沒有太大意義。

在增殖培養(yǎng)中，經(jīng)過方差分析發(fā)現(xiàn)，白牡丹叢生芽增殖倍數(shù)與KT、6-BA顯著相關(guān)，而NAA雖然與增殖倍數(shù)無顯著相關(guān)，但與叢生芽形態(tài)關(guān)聯(lián)密切，叢生芽在NAA與KT、6-BA組合下達到最優(yōu)繁殖水平，這與宋曉濤等的研究結(jié)論[3-4]基本一致，但夏時云等在對龜甲龍的增殖培養(yǎng)中，使用NAA與KT的組合配方也取得良好繁殖[5]。同時，本研究中KT與增殖倍數(shù)的相關(guān)性較6-BA高，這說明有可能僅使用KT的效果也會較好，這還有待進行驗證。

在對多肉植物的煉苗過程中，常規(guī)的保濕條件并不利于多肉的煉苗與移栽。在相對干燥的情況下，白牡丹植株不但沒有出現(xiàn)萎蔫枯死的現(xiàn)象，反而有利于新根的萌發(fā)，這與多肉植物平時的養(yǎng)護種植有一定類似[6]，在常規(guī)繁殖中，也是相對干燥的環(huán)境更有利于根系產(chǎn)生及植株生長，這可能是由多肉植物原本的生境以及自身的一些特性所決定的，具體是哪些因素造成的，也有待進一步研究。

參考文獻：

[1]丁一凡，劉宇，劉婭妮，等. 銀川地區(qū)景天科多肉花卉新品種形態(tài)特征與栽培管理初報[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2015，36（2）：86-90.

[2]孫濤，金蕊，李德森. 康平壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2003，39（3）：232-232.

[3]宋曉濤，沈萌，左志宇，等. 十二卷屬植物西山壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2007，43（5）：883-884.

[4]張昊鵬，宋曉濤，張耀，等. 白銀壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2008，44（5）：951-952.

[5]夏時云，孫濤，李德森. 龜甲龍的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2004，40（5）：589-589.

[6]胡海波，郝永麗，高博，等. 多肉植物繁殖特性概述[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)，2016，36（1）：64-67.endprint