金福源 朱國良（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所盛澤分所 215200）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國東（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所黎里分所 215200）

夏曉潮（廣東省茂名市林業(yè)有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

雞源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

金福源 朱國良（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所盛澤分所 215200）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國東（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所黎里分所 215200）

夏曉潮（廣東省茂名市林業(yè)有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

雞大腸桿菌病是雞感染致病性大腸桿菌后所引發(fā)的局部或者全身性敗血癥癥狀的疾病，臨床菌株易對抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，實驗數(shù)據(jù)表明，除頭孢喹肟和硫酸粘菌素外，大多數(shù)臨床分離株都對所選藥物產(chǎn)生一定耐藥；藥敏試驗表明，復(fù)方類抗生素相比單方抗生素對大腸桿菌病的治療效果要明顯；臨床上遇到本病時建議在成本可控的范圍內(nèi)采用復(fù)方類抗生素或聯(lián)合用藥的方案進行治療。

雞；大腸桿菌；藥敏試驗；耐藥性；分析

大腸桿菌為革蘭氏染色呈陰性、中等大小的桿菌，需氧或微厭氧，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可長成紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤的菌落。目前針對大腸桿菌病的防治措施是使用抗菌藥物。由于抗生素大量使用以及耐藥菌株的不斷增加，大腸桿菌感染的趨勢不但沒有下降反而有所上升，給廣大養(yǎng)殖戶帶來較大損失。筆者通過對全國規(guī)?；B(yǎng)殖場的疑似大腸桿菌病的發(fā)病雞進行菌株分離鑒定，經(jīng)藥敏試驗篩選出對大腸桿菌敏感的藥物供大家選擇，并就雞源大腸桿菌的耐藥情況給大家作一下交流。

1 本病流行特點及防治現(xiàn)狀

雞大腸桿菌病是臨床嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的細菌病之一，可導(dǎo)致雞急性敗血癥、氣囊炎、關(guān)節(jié)滑膜炎、全眼球炎、輸卵管炎、腹膜炎、臍炎和腫頭腫臉綜合征等病癥，尤其以蛋雞和雛雞發(fā)病更為嚴重。雞感染后，一般不單獨發(fā)病，往往繼發(fā)于新城疫、馬立克氏病、傳染性支氣管炎等病毒性疾病。本病發(fā)病率較高。在雞群中可達11～69%，死亡率為3.2～72.9%，給養(yǎng)殖戶帶來較大的經(jīng)濟損失。

上世紀50年代禽致病性大腸桿菌幾乎沒有耐藥性，60年代的分離株對鏈霉素、四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，70年代對氨芐西林，氯霉素，磺胺甲基異惡唑等產(chǎn)生耐藥性，80年代至90年代對阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、萘啶酸、頭孢噻吩等產(chǎn)生耐藥性。隨著時間推移，大腸桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬。

2 臨床菌株的分離以及藥敏試驗

對來自全國各地區(qū)的疑似雞大腸桿菌病的病例進行臨床診斷，并無菌采集典型患雞的心、肝、脾、十二指腸等病料進行分離鑒定和藥敏試驗，具體過程如下。

2.1 分離培養(yǎng)

取病料無菌操作，分別畫線接種于血平板、伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24h，觀察單個菌落的生長情況。

2.2 進一步分離純化

挑取單個菌落接種至伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基上進一步分離純化，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24h后觀察結(jié)果。

2.3 涂片染色鏡檢

取分離純化后的單個菌落進行涂片，革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌的形態(tài)及染色特性。

2.4 菌液配置

取分離純化后的單個菌落，無菌接種于2ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)16h得到菌液。

2.5 藥敏試驗

按K2B紙片擴散法將被檢細菌無菌接種于普通瓊脂平板上，間隔一定距離，然后用無菌鑷子將藥敏紙片放于固體培養(yǎng)基表面并輕壓，使紙片與培養(yǎng)基表面完全緊貼。避免出現(xiàn)抑制圈重疊。一般各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，可在平皿中央貼一片，外周等距離貼4片。貼完紙片的平皿靜置15min后再置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察并記錄抑菌圈的直徑，結(jié)果判斷依據(jù)《紙片法抗菌藥物敏感試驗操作標準（第4版）》進行。

3 臨床菌株的鑒定及耐藥判定

3.1 菌落的形態(tài)及培養(yǎng)特征

在麥康凱和伊紅美藍培養(yǎng)基上在分離出呈圓形、邊緣整齊、隆起、呈紫黑色并帶有金屬光澤的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小、表面光滑濕潤的紅色菌落，符合大腸桿菌的菌落特征。

3.2 鏡檢特征

取單個菌落，涂片，經(jīng)革蘭氏法染色，普通光學顯微鏡下觀察，可見視野中的菌落均為兩端鈍圓，多數(shù)散在排列的革蘭氏陰性桿菌。

3.3 藥敏判定標準

將符合上述特征的菌株收集并進行藥敏試驗，依據(jù)抑菌圈直徑的大小來判定藥敏結(jié)果，敏感度根據(jù)表1來進行判斷。

表1 藥敏試驗敏感性判定標準

4 結(jié)果及分析

4.1 單方藥物的藥敏結(jié)果及分析

本次試驗分別對江蘇、廣東、北京、河南、河北等17個省市地區(qū)的130株大腸桿菌陽性菌株，選取市場上常見的治療大腸桿菌的抗生素進行藥敏試驗，結(jié)果如表2所示。其中，臨床分離的130株大腸桿菌，對阿莫西林、氨芐西林、林可霉素和氟苯尼考的耐藥率都達到了100%，頭孢喹肟對大腸桿菌最敏感，高敏菌株比例達100%，這可能與頭孢喹肟為四代頭孢類藥物，上市時間短且價格昂貴造成普及率不高有關(guān)；其次為硫酸粘菌素，硫酸黏菌素對敏感菌的細胞膜具有較強的吸附作用，使細胞膜的表面張力降低，通透性增加，細胞膜破裂，菌體內(nèi)物質(zhì)外漏，導(dǎo)致細菌死亡；大觀霉素不具有高敏作用，中敏率為63.8%，耐藥率為36.2%。因此，從價格和藥物敏感性來講，單方藥物治療大腸桿菌病時，可優(yōu)先選用硫酸粘菌素。

表2 單方藥物藥敏試驗結(jié)果

4.2 復(fù)方藥物的藥敏結(jié)果及分析

復(fù)方藥物通常指含有本身無抗菌活性但可增加主藥敏感性的活性成分，如舒巴坦本身無抗菌活性，但與內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用后藥效增強幾倍甚至幾十倍。復(fù)方藥物的藥敏試驗結(jié)果如表3所示，可以看出，阿莫西林與克拉維酸合用后可使大腸桿菌對阿莫西林的耐受性從100%降低到6.9%，頭孢噻呋與舒巴坦合用可使大腸桿菌對藥物的耐受性從83.3%降低到30%，頭孢哌酮與他唑巴坦合用可使大腸桿菌對藥物的耐受性從63.3%降低到15%，氨芐西林與舒巴坦合用可使大腸桿菌對藥物的耐受性從100%降低到26.9%。阿莫西林西林克拉維酸合用對大腸桿菌的效果最好，頭孢噻呋舒巴坦合用，以及頭孢哌酮他唑巴坦合用效果也理想，但考慮到頭孢類產(chǎn)品價格較貴，宜首選阿莫西林克拉維酸。氨芐西林與舒巴坦與合用后效果不如其他3種方案，原因可能是有些大腸桿菌臨床菌株對其敏感性并未完全恢復(fù)，同時也表明雞大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機制可能不止一種。

表3 復(fù)方藥物藥敏試驗結(jié)果

4.3 聯(lián)合用藥對大腸桿菌臨床菌株的敏感性分析

兩種或兩種以上藥物同時使用，不僅可以增加抗生素對大腸桿菌的敏感性，還可以降低抗生素的用藥量。本試驗將阿莫西林與硫酸粘菌素、林可霉素與大觀霉素，氟苯尼考與多西環(huán)素，硫酸粘菌素與恩諾沙星等幾種抗生素兩兩聯(lián)合用藥后，對大腸桿菌臨床菌株產(chǎn)生明顯的抑制作用，結(jié)果如表4所示，可以看出阿莫西林與硫酸粘菌素、林可霉素和大觀霉素、氟苯尼考與多西環(huán)素、硫酸粘菌素與恩諾沙星合用以后，比各個藥物單用效果要好，聯(lián)用以后呈協(xié)同作用，尤其以硫酸粘菌素和恩諾沙星合用效果最佳，比各個藥物單用效果增強20多倍，雖然硫酸粘菌素單用時效果也很好，但是其對腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)有一定副作用，因此，將硫酸粘菌素和其他抗生素聯(lián)合用藥，不僅可以增強療效，還可以減輕副作用，降低用藥成本。

表4 聯(lián)合用藥藥敏試驗結(jié)果

5 討論

從全國分離的菌株藥敏試驗結(jié)果來看，雞源大腸桿菌都易產(chǎn)生不同程度的耐藥性，許多抗生素逐漸低效或無效，臨