李永明，李先佳

馬鞭草總黃酮對肝癌HepG-2細胞IL-6、JAK2、STAT3水平的影響

李永明1，李先佳2

目的 分析馬鞭草總黃酮對人肝癌細胞株HepG-2增殖及IL-6、JAK2、STAT3 mRNA水平的影響。方法 采用不同質(zhì)量濃度的馬鞭草總黃酮處理體外培養(yǎng)的肝癌 HepG-2細胞，Real time PCR檢測 IL-6、p-JAK2、p-STAT3表達水平，Western blot法分析JAK2、STAT3蛋白表達水平。結(jié)果 與空白對照組比較，馬鞭草總黃酮能顯著降低 IL-6、p-JAK2、p-STAT3 mRNA表達水平（均 P＜0.05），下調(diào) JAK2、STAT3蛋白水平（P＜0.05）。結(jié)論馬鞭草總黃酮下調(diào)肝癌HepG-2細胞IL-6、JAK2、STAT3水平，抑制細胞增殖。

肝癌；HepG-2；馬鞭草總黃酮；IL-6／JAK2／STAT3

Abstract：Objective To investigate the total flavonoids of Verbena officinalis L（TFV）effect on IL-6、JAK2、STAT3 level of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells. Methods HepG-2 Cells were treated and cultured with different concentrations of TFV.The expression of IL-6、p-JAK2，p-STAT3 mRNA were detected by RT-PCR.Expression of p-JAK2，p-STAT3 protein were analyzed by western blotting.Results Compared with the control group，TFV could significantly decrease the expressions of IL-6，p-JAK2，p-STAT3（all P＜0.05），Moreover，TFV could down-regulate the protein expression of p-JAK2，p-STAT3（P＜0.05）. Conclusion TFV could down-regulate the level of IL-6、JAK2，STAT3 and inhibit the proliferation of HepG-2 cells.

Key words：hepatocellular carcinoma；HepG-2；total flavonoids；Verbena officinalis；IL-6／JAK2／STAT3

馬鞭草具有一定的抗癌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等作用，而黃酮為其有效的活性成分［1］，本組前期研究顯示馬鞭草總黃酮（total flavonoids of Verbena officinalis L，TFV）對肝癌HepG-2細胞的增殖具有一定的抑制作用［2］，但機制還不明確。本研究采用馬鞭草總黃酮體外干預(yù)肝癌HepG-2細胞，觀察其對Hep G-2細胞 IL-6／JAK／STAT信號通路的影響，從mRNA和蛋白質(zhì)水平研究其對IL-6、JAK2、STAT3表達的影響，為新藥的開發(fā)及抗癌機制的研究提供實驗支持，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人肝癌HepG-2細胞（武漢博士德有限公司，批號20161209）。馬鞭草總黃酮（漯河醫(yī)專天然藥物化學(xué)教研室），以蘆丁為標準品，高效液相色譜法在檢測波長510 nm測得總黃酮含量約為81%，溶于適量二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，過濾除菌4℃保存；胎牛血清（杭州四季青生物技術(shù)公司，批號：140130）；四甲基偶氮唑鹽 MTT（美國 Sigma公司，批號：M2128）；DMEM培養(yǎng)基（Dulbeco’s modified eagle medium，DMEM）（美國 Hyclone公司，批號：NAE1396）；TE2000型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；ST-360酶標儀（上海科華實驗系統(tǒng)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Hep G-2細胞培養(yǎng) HepG-2細胞株由漯河市醫(yī)學(xué)生物工程重點實驗室傳代保種，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)，0.25%的胰酶-EDTA消化。

1.2.2 Real time PCR檢測 IL-6、JAK 2、STAT3 mRNA HepG-2細胞以1×105個·mL-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細胞貼壁后，參照前期研究設(shè)置 TFV 50、100、200 mg·L-1組，對照組給予等量培養(yǎng)液，設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，Trizol提取總RNA，測定其濃度。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，引物序列由上海英駿公司提供。IL-6上游引物：5′-TACATCCTCGACGGCATCTC-3′，下游引物：5′-AGGACACTGTCTTTGAGCCT-3′，產(chǎn)物長度 359 bp。p-JAK2上游引物：5′-CTGCCGAGGGATGTGAGTG-3′，下 游 引 物：5′-CAGAACATTTGCCGGCTACAC-3′，產(chǎn)物長度 185 bp。p-STAT3上游引物：5′-AGGAGCATCCTGAAGC-TGAC-3′，下游引 物：5′-CGGCAGGTCAATGGTATTGC-3′，長 度 98 bp。內(nèi)參 GAPDH上游引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCC-3′，下游引物：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′，產(chǎn)物長度262 bp。采用20μL的反應(yīng)體系，其中2×SYBRR Premix Ex-TaqⅡ 10μL，上游（10 μmol）和下游（10μmol）各 0.5μL，cDNA 1μL，PCR級高純水8μL。采用light cycleR 96實時熒光定量PCR儀進行基因擴增。采用Ct值計算基因的相對表達量（相對表達量 ＝2-△△Ct×100%，△Ct＝Ct（待測基因）-Ct（GAPDH）。

1.2.3 Western blot檢測 p-JAK 2、p-STAT3 參照“1.2.2”法設(shè)置各組。細胞培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，Bradford法測定總蛋白的量。SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，室溫封閉1 h，5%山羊血清封閉，室溫孵育 60 min；與一抗 p-JAK2（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、β-actin（1∶500）室溫孵育1 h，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，行ECL反應(yīng)，顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，GIS凝膠成像分析軟件分析，以同一泳道 p-JAK2和 p-STAT3和 β-actin條帶灰度值比反映蛋白表達水平。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 15.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hep G-2細胞 IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表達與空白對照組比較，TFV 50、100、200 mg·L-1組 IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表達水平明顯降低（均 P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖 1。

圖 1 IL-6、JAK 2、STAT3 m RNA表達

2.2 JAK 2、STAT3蛋白表達水平 與空白對照組比較，TFV 50、100、200 mg·L-1組 JAK2、STAT3蛋白表達水平明顯降低（均 P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖2-3。

圖2 Western blot檢測 JAK 2、STAT3蛋白表達

圖3 JAK2、STAT3蛋白表達比較

3 討論

肝癌為常見的惡性腫瘤之一，目前以手術(shù)治療為主，輔以放療、化療及中醫(yī)療法［3］，但治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依然沒有得到有效控制［4］。植物黃酮為高效的天然抗氧化劑，近期研究顯示，植物黃酮可同時具有抗氧化和促氧化兩種相反特性，尤其在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面，有研究顯示促氧化活性可能較抗氧化活性更加重要［5］。本組前期研究顯示，馬鞭草總黃酮能誘導(dǎo)肝癌HepG-2細胞凋亡，并存在明顯的濃度依賴性［6］，而其抗腫瘤機制還不明確，與信號通路之間的關(guān)系也有待進一步研究。

JAK／STAT信號通路主要由酪氨酸激酶JAK家族和轉(zhuǎn)錄因子STAT家族組成，與細胞生長、增殖及分化相關(guān)［7］。JAK2為JAK家族蛋白之一，對免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)具有重要作用［8-9］。王恒等研究顯示，采用莪術(shù)醇作用于 Jurkat細胞 24 h后，JAK2與STAT5a磷酸化蛋白水平下降［10］。姬穎華等研究顯示，白藜蘆醇作用于伯基特淋巴瘤細胞，能通過抑制IL-6水平，調(diào)節(jié) JAK2／STAT3信號通路，并誘導(dǎo)凋亡［11］，提示JAK2在細胞增殖及惡化中的重要地位。而STAT3為JAKs下游的靶蛋白，與多種惡性腫瘤有關(guān)［12-13］，研究表明，當(dāng)STAT3過度活化時，容易導(dǎo)致下游靶基因如 c-myc、survivin等異常表達從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生癌變并阻斷細胞凋亡［14-15］。研究證實，STAT3為IL-6激活的JAK2／STAT3信號通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子［16-18］。

本研究表明，馬鞭草總黃酮作用Hep G-2細胞48 h后，IL-6、p-JAK2、p-STAT3 mRNA水平明顯下調(diào)，下調(diào)HepG-2細胞p-JAK2、p-STAT3蛋白水平。究其原因，馬鞭草總黃酮可能通過抑制JAK2磷酸化水平，進而下調(diào) JAK2下游的 STAT3磷酸化表達，而IL-6為一種功能復(fù)雜且多效的細胞因子，IL-6異常表達可導(dǎo)致STAT3的過度表達，馬鞭草總黃酮對IL-6的影響還有待進一步研究。研究表明，馬錢子堿作用于人結(jié)腸癌SW480細胞后能通過下調(diào)STAT3蛋白進而抑制細胞增殖［19］。Shodeinde等研究表明，下調(diào)STAT3表達水平，能有效地促進細胞凋亡［20］。因此，馬鞭草總黃酮誘導(dǎo)HepG-2細胞凋亡，抑制細胞增殖可能與JAK3／STAT5調(diào)節(jié)基因表達調(diào)節(jié)相關(guān)。

總之，馬鞭草總黃酮可下調(diào)肝癌 HepG-2細胞IL-6、JAK2、STAT3水平，抑制細胞增殖。馬鞭草總黃酮可能通過干預(yù)IL-6／JAK2／STAT3信號通路的活性，從而發(fā)揮較好的抗腫瘤效果，這也為馬鞭草的開發(fā)和利用提供了指導(dǎo)。

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Effect of Total Flavonoids of Verbena officinalis on IL-6、JAK2、STAT3 level of Human Hepatocellular Carcinoma Hep G-2 Cells

LI Yong-ming1，LI Xian-jia2
（1.Department of Anorectal Diseases，People′s Hospital of Yancheng，Luohe 462300，China；2.Department of Biochemistry，Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

R966；R735.7

A

1672-688X（2017）03-0169-03

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.003

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助項目（2015GGJS-288）

2017-04-08

1.漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院肛腸科，河南漯河462300

2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生化教研室，河南漯河462002

李永明（1971—），男，河南漯河人，主治醫(yī)師，從事腫瘤研究工作。

李先佳，男，副教授，E-mail：nzr110＠163.com