響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化亞臨界水提取核桃粕蛋白工藝及其氨基酸分析

汪正興，韓 強(qiáng)，郜海燕,*，陳杭君，房祥軍，穆宏磊

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化亞臨界水提取核桃粕蛋白工藝及其氨基酸分析

汪正興1,2，韓 強(qiáng)1，郜海燕1,*，陳杭君1，房祥軍1，穆宏磊1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036）

本研究以新疆核桃粕為實(shí)驗(yàn)原料，利用亞臨界水輔助提取核桃粕蛋白，分別以提取時(shí)間、料液比、提取溫度、pH值為單因素研究對(duì)蛋白提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定合適的因素水平，以響應(yīng)面優(yōu)化分析得到核桃粕蛋白提取的最佳條件。結(jié)果表明：核桃粕的最佳提取工藝為pH 9.0、料液比1∶25（g/mL）、提取溫度133 ℃，此條件下的蛋白提取率可達(dá)到75.01%。氨基酸的結(jié)果分析表明：氨基酸種類(lèi)齊全，谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸3 種含量最高，共占氨基酸總量的59.7%，必需氨基酸占20.03%。亞臨界水提取蛋白的提取率較高，操作方便，適用于核桃粕蛋白提取。

核桃粕；亞臨界水；蛋白提??；響應(yīng)面；氨基酸分析

核桃（Juglans regia L.）又稱(chēng)胡桃，羌桃，為胡桃科植物。與扁桃、腰果、榛子并稱(chēng)為世界著名的“四大干果”[1]。我國(guó)是核桃生產(chǎn)和消費(fèi) 大國(guó)，占世界核桃出口總量的45.6%，主產(chǎn)區(qū)主要分布在新疆、四川、云南以及西北等地區(qū)，其中，新疆由于優(yōu)越的自然條件，其生產(chǎn)的核桃皮薄、仁多、顆粒大而被人熟知，近年來(lái)，由于國(guó)家政策的支持，新疆地區(qū)種植核桃面積逐漸增大，核桃產(chǎn)量穩(wěn)步提升，受到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞[2]。我國(guó)的核桃產(chǎn)品主要集中于生產(chǎn)糧油，炒制以及作為輔料等，相比于發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)的核桃加工規(guī)模小、產(chǎn)品種類(lèi)少、起步較晚，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家的核桃產(chǎn)品加工業(yè)?，F(xiàn)階段，對(duì)于核桃的加工利用主要用于核桃油壓榨，得到可食用的核桃油產(chǎn)品，除此之外還有核桃營(yíng)養(yǎng)粉和乳飲料及一些休閑食品[3]。

核桃油是核桃的主要成分，且是一種高級(jí)食用油，在加工的過(guò)程會(huì)產(chǎn)生附加產(chǎn)物核桃粕，其蛋白含量高達(dá)30%左右[4]，核桃粕含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、油脂、維生素和礦物質(zhì)且含有18 種氨基酸，滿(mǎn)足人體需要的8 種氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸含量十分豐富[5-6]。但在實(shí)際的生產(chǎn)中核桃粕作為飼料或直接遺棄，原料未能充分利用，多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也隨之流失造成浪費(fèi)。同時(shí)，因其高蛋白含量，直接遺棄對(duì)環(huán)境也帶來(lái)了較大的負(fù)面影響，易造成土壤和水資源的富營(yíng)養(yǎng)化污染。因此，對(duì)核桃粕進(jìn)行精深加工和有效利用具有十分重要的意義。

目前，核桃粕蛋白提取的方法主要有堿溶酸沉法、膜分離法和離子交換法、物理輔助法[7]。堿溶酸沉法工藝簡(jiǎn)單，但酸堿消耗過(guò)大，成本過(guò)高[8]。膜分離法耗能低、操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染，但超濾膜易污染，會(huì)影響蛋白性能的改變[9]。離子交換法的優(yōu)點(diǎn)在于得到的蛋白純度較高，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)。物理輔助法有超聲波法、微波法以及亞臨界水萃取法等。

亞臨界水萃取法是將水作為提取劑，通過(guò)改變壓力，使水的溫度達(dá)到100～374 ℃范圍，此時(shí)水仍然是液態(tài)[10-11]。與常溫水相比有更強(qiáng)的分解能力和溶解有機(jī)物的特性，類(lèi)似于有機(jī)溶劑[12-13]。亞臨界萃取技術(shù)是新興發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)變革性技術(shù)，亞臨界水相比于其他的輔助方法，其提取時(shí)間短、提取效率高、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)[14]。同時(shí)亞臨界水提取在核桃粕蛋白提取上鮮有報(bào)道，本研究采用亞臨界水提取蛋白，通過(guò)工藝條件優(yōu)化，為核桃粕蛋白提取提供新型方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆核桃粕（油壓冷榨后得到）、牛血清蛋白南京建成生物工程研究所有限公司；氫氧化鈉、鹽酸南通凱瑞化工有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Cintra 20紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 澳大利亞GBC公司；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；LABCONCO低溫冷凍干燥機(jī) 上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司；CEM MARS6高通量密閉微波消解系統(tǒng) 美國(guó)培安科技公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃蛋白提取工藝

參考王豐俊等[15]的方法：選取色澤較好沒(méi)有霉?fàn)€的大核桃餅粕適量，用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理至細(xì)末狀后過(guò)80目篩，按照比例加入到先前配好的氫氧化鈉溶液中，搖勻，放入到微波消解儀中處理30 min，消解完成后靜置30 min，充分冷卻。將冷卻后的樣品離心后取上清液，按照考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白。

1.3.2 核桃蛋白提取率計(jì)算

本實(shí)驗(yàn)中以蛋白提取率為指標(biāo)[16]，按以下公式計(jì)算：

式中：Y為提取率/%；m1為提取液蛋白質(zhì)量/g；m2為核桃粕蛋白質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在提取時(shí)間30 min、料液比1∶20（g/mL）、pH 9的條件下，考察提取溫度（110、120、130、140、150、160 ℃）對(duì)蛋白提取率的影響。

在提取時(shí)間30 min、pH 9、提取溫度130 ℃的條件下，考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））對(duì)核桃粕蛋白提取率的影響。

在提取時(shí)間30 min、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度130 ℃的條件下，考察pH值（8、8.5、9、9.5、10.5）對(duì)核桃粕蛋白提取率的影響。

在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度130 ℃、pH 9的條件下，考察提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)核桃粕蛋白提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定提取時(shí)間30 min不變，以提取溫度、pH值、料液比為試驗(yàn)因素，并以-1、0、1 為自變量的低、中、高水平，以核桃粕的蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Coded levels of independent variables used for response surface methodology

1.3.5 游離氨基酸的組成分析

參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定方法》[17]，使用氨基酸自動(dòng)分析儀分析氨基酸組成[18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。響應(yīng)面數(shù)據(jù)采用Design-Expert軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[19]。其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用考馬斯亮藍(lán)方法[20]，以蛋白質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到線(xiàn)性方程：A=0.006 1X+0.007 8 ，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，說(shuō)明牛血清蛋白在0～100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 微波消解提取核桃粕蛋白單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)核桃粕蛋白提取的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig. 1 Effect of extraction time on the extraction effi ciency of protein

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃粕的蛋白提取率逐漸增加，這與王琳等[21]的研究結(jié)果相似，提取時(shí)間20～30 min，蛋白的提取率顯著提高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率趨于平衡，開(kāi)始時(shí)蛋白沒(méi)有完全溶解，提取率較低，當(dāng)?shù)鞍兹艹隽窟_(dá)到一定量后只有很少一部分溶解，從節(jié)約時(shí)間和提取率角度考慮，提取時(shí)間控制在30 min較好，因此選30 min為提取蛋白的最佳時(shí)間。

2.2.2 pH值對(duì)核桃粕蛋白提取率的影響

圖2 pH值對(duì)蛋白提取率的影響Fig. 2 Effect of pH on the extraction effi ciency of protein

由圖2可知，核桃粕蛋白提取率隨著pH值的升高，蛋白提取率逐漸增大，當(dāng)pH值在低范圍內(nèi)，蛋白的提取效率較低，與范方宇[22]和Yuan Yingjin[23]等研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)的顏色會(huì)越來(lái)越深，當(dāng)pH值達(dá)到9時(shí)，蛋白的提取率逐漸下降，可能因?yàn)榈鞍椎幕窘Y(jié)構(gòu)中含有氨基和羧基2 種官能團(tuán)，不同的pH值環(huán)境會(huì)影響其存在方式，進(jìn)而改變?nèi)艹鲂Ч鸞24]。因此選擇pH值為8.5、9.0、9.5這3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.3 料液比對(duì)核桃粕蛋白提取率的影響

圖3 料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig. 3 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction effi ciency of protein

由圖3可知，隨著溶劑用量的增大，核桃粕的蛋白提取率逐漸增大，與Venkatachalam等[25]研究結(jié)果一致，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）時(shí)，蛋白提取率增大逐漸緩慢，這是由于蛋白的溶解度達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加溶劑不再溶解[26]，選取料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.4 提取溫度對(duì)核桃粕蛋白提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig. 4 Effect of temperature on the extraction effi ciency of protein

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，核桃粕蛋白提取率隨著溫度的增大而減小，與Wiboonsirikul[27]和Sereewatthanawut[28]等研究結(jié)果一致。提取溫度在140 ℃時(shí)，蛋白提取率出現(xiàn)最大值。當(dāng)溫度高于140 ℃以后，蛋白的提取率開(kāi)始逐漸下降。溫度較高時(shí)，水發(fā)生了解離現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化為H+和OH-離子，Sereewatthanawut等[28]利用色譜分析也證明了水的解離現(xiàn)象，與此同時(shí)，在高溫的條件下蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生降解，轉(zhuǎn)化為多肽和氨基酸等一些小分子物質(zhì)[28]。所以130 ℃為提取蛋白的較優(yōu)條件，選取120、130、140 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的3 個(gè)水平。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、料液比、pH值3 個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平利用Design-Expert 8.0軟件按照Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的試驗(yàn)方案對(duì)核桃粕蛋白提取進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

2.3.2 回歸方程方差分析

根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行分析，得到料液比、pH值、料液比的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=76.16+2.19A+1.00B+2.76C-0.62AB-0.84AC-0.035BC-2.62A2-6.21B2-3.81C2。

表3 回歸方差分析Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

由表3可知，回歸模型極顯著，R2=0.981 2＞0.9，說(shuō)明模型的相關(guān)度很好。模型的失擬項(xiàng)不顯著，表明模型選擇合適，方程的一次項(xiàng)對(duì)蛋白提取率的影響均顯著。

2.3.3 響應(yīng)面交互分析與結(jié)果優(yōu)化

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面圖來(lái)進(jìn)行可視化分析，圖5～7分別顯示3 組以蛋白提取率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖。趨勢(shì)圖中等高線(xiàn)直觀(guān)地反映兩變量交互作用的顯著程度，橢圓表示兩因素交互作用顯著，而圓形與之相反[25]。響應(yīng)面的坡度平緩表示兩因素的交互作用不顯著，坡度較陡表示兩因素交互作用顯著。

圖5 料液比和pH值對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig. 5 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of solid-to-solvent ratio and pH on the extraction effi ciency of protein

由圖5可見(jiàn)，等高線(xiàn)成橢圓形，響應(yīng)面坡度較陡，說(shuō)明料液比與pH值之間的交互作用明顯；料液比相同，隨著pH值的增大，蛋白提取率增大，pH值進(jìn)一步增加，蛋白提取率反而下降，這是由于蛋白質(zhì)以離子狀態(tài)的形式溶解出來(lái)，繼續(xù)提高pH值會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，造成蛋白提取率降低[29]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pH值的變化會(huì)引起蛋白質(zhì)溶液顏色的改變，pH值越大其顏色也會(huì)越來(lái)越深。在pH值一定的條件下，隨著溶劑用量的不斷增加，其蛋白提取率先逐漸增加后增加緩慢，這是由于蛋白質(zhì)具有一定的溶解度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)達(dá)到飽和時(shí)，其不再溶解。

圖6 料液比和提取溫度對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig. 6 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of solid-to-solvent ratio and temperature on the extraction effi ciency of protein

由圖6可知，料液比和提取溫度對(duì)蛋白提取率的響應(yīng)面圖，等高線(xiàn)成橢圓形，響應(yīng)面坡度較陡，說(shuō)明料液比與提取溫度之間的交互作用明顯。料液比一定時(shí)，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率先增大后減小，這是由于溫度升高，部分蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，溶解度降低。當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨著溶劑用量的增大蛋白提取率先逐漸增大后增加緩慢。

圖7 pH值和提取溫度對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig. 7 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of pH and temperature on the extraction effi ciency of protein

由圖7可見(jiàn)，等高線(xiàn)成橢圓形，響應(yīng)面坡度較為平緩，說(shuō)明pH值與提取溫度之間的交互作用不明顯。pH值一定時(shí)，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率先增加后減少。當(dāng)提取溫度一定時(shí)，pH值增大，蛋白提取率呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)變化。

綜上所述，蛋白提取率與料液比、pH值、提取溫度有著很強(qiáng)的顯著性，經(jīng)過(guò)軟件分析得到最佳工藝條件為料液比1∶25、pH 9.02、提取溫度132.5 ℃，預(yù)測(cè)的最大提取率為75.43%。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行核桃粕蛋白提取實(shí)驗(yàn)，考慮實(shí)際操作的便利，將工藝條件修正為提取溫度133 ℃、pH 9、料液比1∶25（g/mL），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，所得的核桃粕蛋白提取率分別為74.89% 、75.23%、74.91%，平均值為75.01%，與預(yù)測(cè)值75.43%較為接近，說(shuō)明模型可以很好地預(yù)測(cè)蛋白提取情況。

2.5 核桃蛋白氨基酸成分分析結(jié)果

表4 核桃蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of walnut protein

如表4所示，檢測(cè)到核桃蛋白中共17 種氨基酸，種類(lèi)較為齊全，未檢測(cè)到色氨酸，可能是因?yàn)樵趬A性條件下水解。核桃蛋白包含人體必需氨基酸7 種（色氨酸除外），其占總量的20.03%，蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸、酪氨酸、半胱氨酸含量較少，但是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量較高，分別占氨基酸總量的19.7%、15.2%、24.8%，這與張慶祝等[5]報(bào)道的結(jié)果相似。高含量的谷氨酸是表征核桃蛋白的一個(gè)重要特性，它可以促進(jìn)機(jī)體生物代謝，提高大腦思維活躍水平，可以用于治療神經(jīng)衰弱和記憶力減退[30]。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)核桃粕中蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化后的最佳亞臨界水提取工藝為提取溫度133 ℃、料液比1∶25（g/mL）、堿溶pH 9.0，核桃粕蛋白的提取率為75.43%。響應(yīng)面法優(yōu)化方法得到各因素對(duì)蛋白提取率的影響順序由大到小為提取溫度＞液料比＞pH值。利用響應(yīng)面分析方法對(duì)亞臨界水提取核桃粕蛋白提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可以獲得最佳的工藝參數(shù)，同時(shí)，氨基酸的組成分析結(jié)果表明，核桃蛋白的氨基酸種類(lèi)較為齊全，含量合理，必需氨基酸含量較高，同時(shí)精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量豐富，因此核桃粕中提取的蛋白質(zhì)可以作為優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

[1] 黃黎慧, 黃群, 孫術(shù)國(guó). 核桃的營(yíng)養(yǎng)保健功能與開(kāi)發(fā)利用[J]. 糧食利技與經(jīng)濟(jì), 2009, 3(4): 48-50. DOI:10.16465/j.gste.2009.04.006.

[2] 盛來(lái)運(yùn). 中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒: 13-17主要林產(chǎn)品產(chǎn)量[M]. 北京: 中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社, 2010: 489.

[3] 李艷伏. 核桃粕多肽提取分離及功能特性研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2008: 12-23.

[4] 王志平, 楊栓平, 李文德, 等. 核桃油及維生素E復(fù)合核桃油對(duì)動(dòng)物功能行為影響的研究[J]. 山西醫(yī)藥雜志, 2000, 29(4): 325-326.DOI:10.3969/j.issn.0253-9926.2000.04.025.

[5] 張慶祝, 丁曉雯, 陳宗道, 等. 核桃蛋白質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂,2003(5): 21-23. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2009.09.068.

[6] REVAI M. Quality characteristics of California walnuts[J]. Cereal Foods World, 1992, 37(5): 365-366.

[7] 楊瑾. 山核桃餅粕蛋白質(zhì)提取純化工藝及其功能特性的研究[D].合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012:10-16.

[8] 張凱, 吳衛(wèi)國(guó). 大米蛋白提取工藝研究進(jìn)展[J]. 糧食加工, 2010,35(3): 38-40. DOI:10.3969/j.issn.1007-6395.2010.03.011.

[9] 雷淑芳, 晃芳芳, 張雪蒼. 大豆分離蛋白的生產(chǎn)工藝及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 糧食加工, 2004, 29(4): 53-56. DOI:10.3969/j.issn.1007-6395.2004.04.014.

[10] SMITH R M. Extractions with superheated water[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 975(1): 31-46. DOI:110.1016/S0021-9673(02)01225-6.

[11] 張海暉, 武妍, 段玉清, 等. 亞臨界水萃取米糠蛋白工藝與功能特性研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2011, 42 (11): 139-143. DOI:10.3969/j.issn.1000-1298.2011.11.026

[12] LI B, YANG Y, GAN Y X, et al. Online coupling of subcritical water extraction with high-performance liquid hromatography via solid-phase trapping[J]. Chromatography A, 2000, 873∶ 175-184.DOI∶10.1016/S0021-9673(99)01322-9.

[13] MCGOWIN A E, ADOM K K, OBUBUAFO A K. Sreening of compost for PAHs and pesticides using static subcritical water extraction[J]. Chemosphere, 2001, 45(6/7)∶ 857-864. DOI∶10.1016/S0045-6535(01)00043-1.

[14] 劉淑蘭, 張永忠, 姚琪, 等. 亞臨界水法提取大豆醬渣餅中總異黃酮的研究[J]. 中國(guó)油脂, 2010, 35(11): 64-67.

[15] 王豐俊, 楊朝暉, 馬磊, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃蛋白提取工藝研究[J].中國(guó)油脂, 2011, 36(3): 33-37. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201418008.

[16] 毛曉英. 核桃蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征及其制品的改性研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2012: 30-31.

[17] 衛(wèi)生部, 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析法: GB/T 5009.39—2003[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003: 320-323.

[18] 李超, 楊文鴿, 徐大龍, 等. 電子束輻照對(duì)泥蚶肉營(yíng)養(yǎng)成分影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào), 2011, 25(5): 959-964.

[19] JEFFWU C F, MICHAEL H. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析及參數(shù)優(yōu)化[M]. 張潤(rùn)楚, 鄭海濤, 蘭燕, 等, 譯. 北京: 中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社, 2003: 130-141.

[20] 李加興, 房惠芳, 陳選, 等. 牡丹籽粕蛋自提取工藝優(yōu)化及其等電點(diǎn)分析[J]. 食品與機(jī)械, 2014, 30(3): 147-149. DOI∶10.3969/j.issn.1003-5788.2014.03.037.

[21] 王琳, 李芳, 王文杰, 等. 核桃蛋白提取工藝優(yōu)化及SDS-PAGE分析[J].食品工業(yè), 2016(10): 50-54.

[22] 范方宇, 王艷萍, 馬艷娟, 等. 核桃蛋白提取工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2010(5): 13-15. DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2010.05.003.

[23] YUAN Y J, VELEV O D, CHEN K, et al. Effect of pH and Ca2+induced associations of soybean proteins[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2002, 50(17): 4953-4958. DOI:10.1021/jf025582d.

[24] 劉雙鳳, 王華生. 山核桃餅粕蛋白提取工藝的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械,2015(4): 187-190. DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2015.04.048.

[25] VENKATACHALAM M, SATHE S K. Chemical composition of selected edible nut seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(13)∶ 4705-4714. DOI∶10.1021/jf0606959.

[26] 趙見(jiàn)軍, 張潤(rùn)光, 馬玉娟, 等. 核桃粕中蛋白提取工藝的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(18): 40-46. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201418008.

[27] WIBOONSIRIKUL J, KIMURA Y, KADOTA M, et al. Properties of extracts from defatted rice bran by its subcritical water treatment[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2007, 55(21): 8759-8765.DOI:10.1021/jf072041l.

[28] SEREEWATTHANAWUT L, PRAPINTIP S, WATCHIRARUJI K,et al. Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(3):555-561. DOI:10.1016/j.biortech.2006.12.030.

[29] 陳珊珊, 丁俏羽, 李佳, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化蝦殼可溶性鈣提取工藝[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(6): 81-89. DOI:10.16429/j.1009-7848.2014.06.009.

[30] 吳啟南, 王立新, 吳德康, 等. 合子草中氨基酸及無(wú)機(jī)元素成分分析[J].時(shí)珍國(guó)藥研究, 1996, 7(4): 204-205.

Optimization of Subcritical Water Extraction of Walnut Meal Protein by Response Surface Methodology and Amino Acid Analysis

WANG Zhengxing1,2, HAN Qiang1, GAO Haiyan1,*, CHEN Hangjun1, FANG Xiangjun1, MU Honglei1
(1. Key Laboratory of Postharvest Preservation and Processing of Fruits and Vegetables, China National Light Industry,Key Laboratory of Fruits and Vegetables Postharvest and Processing Technology Research of Zhejiang Province,Key Laboratory of Post-Harvest Handing of Fruits, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science, Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021, China; 2. College of Tea and Food Science Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

The subcritical water extraction of walnut meal protein was optimized by response surface methodology. The variables optimized were extraction time, solid-to-solvent ratio, extraction temperature and pH. The response was the extraction yield of protein. One-factor-at-a-time method was used to determine the appropriate levels of independent variables for further optimization by response surface methodology. The results showed that the optimal conditions were as follows: pH, 9.0; solid-to-solvent ratio, 1:25 (g/mL); and temperature, 133 ℃. Under these conditions, the extraction yield was up to 75.01%. The results of amino acid analysis indicated that the walnut protein contained almost all kinds of amino acids with glutamic acid, arginine, and aspartate being the predominant amino acids, accounting for 59.7% of the total amino acids. Essential amino acids accounted for 20.03%. Sub critical water extraction could be considered as convenient and effi cient method for the extraction of walnut protein.

walnut meal; subcritical water; protein extraction; response surface methodology; amino acid analysis

10.7506/spkx1002-6630-201720027

TS201.1

A

1002-6630（2017）20-0191-06

汪正興, 韓強(qiáng), 郜海燕, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化亞臨界水提取核桃粕蛋白工藝及其氨基酸分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20):191-196. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720027. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhengxing, HAN Qiang, GAO Haiyan, et al. Optimization of subcritical water extraction of walnut meal protein by response surface methodology and amino acid analysis[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 191-196. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720027. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-27

浙江省科技廳援疆項(xiàng)目（2015C26006）；國(guó)家自然科學(xué)基金 面上項(xiàng)目（31571907）；

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2015C32032）

汪正興（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品物流保鮮與質(zhì)量控制研究。E-mail：18858114583@163.com

*通信作者：郜海燕（1958—），女，研究員，博士，主要從事食品物流保鮮與質(zhì)量控制研究。 E-mail：spsghy@163.com