熒光微球免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)河鲀毒素

張世偉，王士峰，姚添琪，楊國(guó)武，賴心田

熒光微球免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)河鲀毒素

張世偉，王士峰，姚添琪，楊國(guó)武，賴心田

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518102）

建立河鲀毒素的熒光微球免疫層析檢測(cè)方法。基于抗體親和位點(diǎn)保護(hù)標(biāo)記方法制備抗河鲀毒素抗體偶聯(lián)熒光微球，方法簡(jiǎn)單穩(wěn)定，所有結(jié)合分離步驟均在親和柱中完成，避免了親和位點(diǎn)被破壞而且熒光信號(hào)更強(qiáng)，將檢測(cè)靈敏度提高至原來(lái)的8 倍左右。所建立的河鲀毒素檢測(cè)方法IC50為18.4 ng/mL，線性范圍為2～200 ng/mL（y =-0.15ln x+0.95，R2=0.98）。檢測(cè)河鲀樣本的最低檢出限為10 μg/kg，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于25%（n=6）。該方法適用于熱加工樣品的檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需15 min，且無(wú)需使用大型設(shè)備，為河鲀餐前速測(cè)提供了一定技術(shù)手段。

河鲀毒素；親和位點(diǎn)保護(hù)；熒光微球；免疫層析

河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種劇毒的天然非蛋白質(zhì)類神經(jīng)毒素，分布廣泛，不僅存在河鲀魚(yú)中，也存在于其他海洋動(dòng)物體內(nèi)，如織紋螺，是已知毒性最強(qiáng)的海洋生物毒素之一[1]。它通過(guò)對(duì)鈉離子通道的阻斷作用而抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，使感覺(jué)神經(jīng)麻痹，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡，其毒力比氰化鈉大1 000 倍，人畜誤食后均能致死[2-4]。

由于河鲀?nèi)馕鄂r美，營(yíng)養(yǎng)豐富，因此被人們視為美味，尤其在亞洲國(guó)家，人們自古就有嗜吃河鲀的習(xí)慣。近年來(lái)主要東方鲀品種（如暗紋東方鲀、紅鰭東方鲀等）的人工繁殖和苗種培育的成功，加速推進(jìn)了我國(guó)河鲀?nèi)斯ゐB(yǎng)殖的發(fā)展，產(chǎn)量和外銷量不斷增加。目前我國(guó)養(yǎng)殖的河鲀已占世界河鲀產(chǎn)量的70%，每年大量外銷日本、韓國(guó)等國(guó)，河鲀已成為我國(guó)一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ奶厣a(chǎn)品。河鲀體內(nèi)含有的TTX化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般烹調(diào)手段難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施，嚴(yán)重威脅到消費(fèi)者的食用安全，因此河鲀加工時(shí)必須完全去除毒性富集部位，如內(nèi)臟、眼球、表皮。盡管加工河鲀有著嚴(yán)格的規(guī)定，TTX中毒的案例仍然時(shí)有發(fā)生[5-7]。解決這一問(wèn)題的方法就是建立TTX的前端預(yù)警體系，在消費(fèi)者食用前對(duì)所加工的河鲀進(jìn)行毒性速測(cè)。

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展為小分子海洋毒素的快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)[8-11]。Kawatsu等[12]曾以甲醛作為交聯(lián)劑合成了TTX人工抗原并首次制備了TTX單克隆抗體。劉燕婷等[13]采用戊二醛作為交聯(lián)劑制備了TTX抗原，但并未見(jiàn)后續(xù)檢測(cè)方法的報(bào)道。Ling Sumei等[14]建立了TTX的酶聯(lián)免疫吸附法快速檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)到5 ng/mL，使TTX免疫學(xué)檢測(cè)方法達(dá)到了實(shí)際應(yīng)用的要求。然而，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)步驟仍然較為繁瑣，無(wú)法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)。目前TTX的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)主要采用膠體金免疫層析法，但其靈敏度較差。熒光素作為抗體標(biāo)記物能有效的放大免疫反應(yīng)信號(hào)，與膠體金標(biāo)記相比靈敏度提高了10～100 倍[15-18]。然而，其容易被食品中的基質(zhì)干擾，目前成功商品化的食品免疫熒光檢測(cè)試劑仍然較少。近年來(lái)興起的熒光微球材料（fluorescent microspheres，F(xiàn)M）為提高免疫層析靈敏度提供了新的解決方案，其通過(guò)將熒光素包裹在熒光微球中，避免了基質(zhì)和熒光素的近距離接觸，從而避免了熒光信號(hào)的淬滅[19-22]。本研究采用熒光微球標(biāo)記的免疫層析技術(shù)，提高了TTX免疫層析技術(shù)的靈敏度，使其能實(shí)際用于TTX的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸纖維膜（NC膜）、熒光硅球墊、樣品墊、吸水紙及PVC底板 美國(guó)Millipore公司；FluoSpheres?羧基修飾的熒光微球（直徑0.2 μm、激發(fā)波長(zhǎng)540 nm、發(fā)射波長(zhǎng)560 nm）、AminoLink Plus Immobilization Kit 美國(guó)Thermo公司；TTX 成都曼斯特生物科技公司；大田軟海綿酸、石房蛤毒素、微囊藻毒素、雙鞭甲藻毒素、軟骨藻酸 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XYZ3100點(diǎn)膜儀 美國(guó)Bio-Dot公司；試紙條讀取儀深圳市三方圓生物科技有限公司；Milli-Q水處理系統(tǒng)美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 TTX抗體制備

以Zhou Jie等[23]報(bào)道的甲醛交聯(lián)法合成TTX抗原，單克隆抗體制備參照文獻(xiàn)[24]報(bào)道的方法。采用辛酸硫酸銨純化抗體。

1.3.2 TTX抗體-熒光微球偶聯(lián)物的制備

采用保護(hù)親和位點(diǎn)法標(biāo)記熒光微球，標(biāo)記流程如圖1所示。使用AminoLink Plus Immobilization Kit將TTX偶聯(lián)于含醛基活化的瓊脂糖凝膠上后，用氰基硼氫化鈉還原所形成的不穩(wěn)定碳氧雙鍵，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。將2 mL 5 mg/mL的TTX抗體和2 mL上述偶聯(lián)完成的瓊脂糖凝膠混合，室溫孵育10 min后，裝入離心柱，離心去除為結(jié)合的抗體，使用6 mL 0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）分3 次洗滌凝膠。0.2 mg的熒光微球加入到2.7 mL、0.01 mol/L PBS中，加入1.0 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺進(jìn)行活化，然后加入含瓊脂糖凝膠的離心柱中，渦旋混勻，靜置室溫孵育1 h后離心去除液體。使用4 mL 0.1 mol/L pH 3.0的甘氨酸鹽酸緩沖液作為洗脫液分兩次淋洗瓊脂糖凝膠。洗脫液立即用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.0，得到標(biāo)記好的TTX抗體-熒光微球偶聯(lián)物。同時(shí)，按傳統(tǒng)的標(biāo)記方法，分別以投料比為1∶10、1∶30、1∶100標(biāo)記熒光微球[25]。偶聯(lián)后的抗體分別使用下述不同配方的熒光抗體稀釋液稀釋用于試紙條 制備：

配方1：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含2%果糖、1%聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品（polyethylene glycol，PEG）40000、5%蔗糖、1%牛血清白蛋白（albumin bovine serum，BSA）、0.4%吐溫-20[26]；配方2：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含2%果糖、1% PEG 40000、5%蔗糖、BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3；配方3：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含5%海藻糖、1% PEG 40000、1% BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3；配方4：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含5%海藻糖、1% PEG 40000、1% PVP K-40、1% BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3；配方5：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含5%海藻糖、0.2%精氨酸、1% PEG 40000、1% PVP K-40、1% BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3。

圖1 抗體親和位點(diǎn)保護(hù)標(biāo)記流程Fig. 1 Schematic illustration of the binding site protection procedure for antibody

1.3.3 熒光試紙條的制備

熒光試紙條結(jié)果如圖2所示。首先將樣本墊浸泡于20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4，含1.0% BSA，0.25% Tween-20、1% PVP K-40、0.5% PEG 40000和0.1% NaN3）中，于60 ℃干燥2 h；將TTX-BSA偶聯(lián)物（2.5 mg/mL）和羊抗鼠多抗（0.3 mg/mL）噴涂于NC膜上，分別作為T(mén)TX試紙條檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），于37 ℃真空干燥12 h。結(jié)合墊噴有TTX抗體偶聯(lián)熒光微球，室溫真空干燥12 h。最后將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊和經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣本墊順序粘貼在PVC底板上，用自動(dòng)切條機(jī)切成4 mm寬的試紙條，室溫條件下真空干燥，備用。

圖2 熒光微球免疫層析試紙檢測(cè)原理示意圖Fig. 2 Schematic illustration of detection of TTX by microsphere-based fl uorescence immunochromatographic strip

1.3.4 定量曲線的建立

將陰性條件下T線熒光信號(hào)/C線熒光信號(hào)（FIT/FIC）值記為B0，TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的FIT/FIC記為B，以B/B0為縱坐標(biāo)，TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，使用Origin 8.0建立四參數(shù)擬合曲線。以B/B0在0.2～0.8的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)建立基于最小二乘法的線性回歸方程。

1.3.5 方法穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

選取色譜確證為T(mén)TX陰性的黑鰓兔頭鲀?nèi)鈽?，TTX加標(biāo)量為0.5 mg/kg。使用同批和不同批次熒光試紙條連續(xù)6 d對(duì)加標(biāo)和未加標(biāo)樣品其進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 真實(shí)樣品的方法比對(duì)

取1 g均質(zhì)的河鲀組織，加入4 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS，渦旋振蕩2 min，0.45 μm過(guò)濾上清液，取上清液0.1 mL滴加至熒光免疫層析試紙的樣品墊，10 min后讀取結(jié)果。液相色譜法為GB/T 23217—2008《水產(chǎn)品中河鲀毒素的測(cè)定 液相色譜-熒光檢測(cè)法》所規(guī)定的方法[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記方法的對(duì)比

抗體的熒光微球標(biāo)記一直是建立熒光免疫層析方法的重點(diǎn)也是實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)。熒光微球和抗體的投料比過(guò)高會(huì)導(dǎo)致抗體活性的喪失，而過(guò)低則影響熒光信號(hào)強(qiáng)度，均會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的降低，因此，過(guò)去一直需要摸索一系列的投料比，工作量非常大且結(jié)果不穩(wěn)定，試劑的批間差較大。本研究建立的保護(hù)抗體親和位點(diǎn)標(biāo)記法，將抗體親和于固定化抗原的瓊脂糖凝膠上，保護(hù)了抗體活性位點(diǎn)，再加入超過(guò)量的活化熒光微球，在抗體上盡可能地標(biāo)記上熒光微球，從而在不影響抗體活性的基礎(chǔ)上，大大增加了抗體的熒光信號(hào)，并且由于熒光微球和抗體的投料比超過(guò)量，因此每批制備的標(biāo)記抗體熒光信號(hào)均一。圖3對(duì)比了本研究建立的抗體活性位點(diǎn)保護(hù)標(biāo)記法和傳統(tǒng)標(biāo)記方法對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。傳統(tǒng)方法考察了3 個(gè)投料比，其中1∶30獲得了最佳的靈敏度，其IC50為156 ng/mL。而本研究使用的方法IC50為18.4 ng/mL，靈敏度提高至原來(lái)的8 倍左右。該方法標(biāo)記洗脫后的親和柱可重復(fù)使用4～5 次，過(guò)量加入的熒光微球離心回收后可繼續(xù)使用，大大降低了標(biāo)記成本。本課題組使用該策略還進(jìn)行了抗體的酶標(biāo)記和生物素標(biāo)記，均取得了良好的效果。

圖3 不同標(biāo)記方法標(biāo)記抗體的熒光免疫層析標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=6）F ig. 3 Representative detection standard curves for different labeled antibodies (n = 6)

2.2 檢測(cè)方法參數(shù)

圖4 肉眼觀察TTX熒光微球免疫層析條抑制情況Fig. 4 Inhibition of TTX fl uorescent immunochromatography observed by naked eye

基于保護(hù)標(biāo)記的熒光微球標(biāo)記抗體所建立的免疫層析方法，其檢測(cè)不同質(zhì)量濃度TTX的試紙條在580 nm激發(fā)波長(zhǎng)下如圖4所示。根據(jù)圖3計(jì)算其線性范圍為2～200 ng/mL（R2＞0.98），回歸方程為y = -0.15lnx+0.95（R2= 0.98）。如表1所示，該方法與各海洋毒素的交叉反應(yīng)率小于1.0%，特異性良好。以線性范圍的最低點(diǎn)2 ng/mL乘以其樣本前處理稀釋倍數(shù)5得到其最低檢出限為10 μg/kg。

表1 與各 海洋毒素的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reactivity of antibody with marine toxins

2.3 熒光抗體稀釋液配方對(duì)試劑有效期的影響

熒光免疫層析技術(shù)由于靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法大大提高，被越來(lái)越多地用于體外診斷領(lǐng)域。然而，食品樣品基質(zhì)比臨床樣本更加復(fù)雜，直接標(biāo)記熒光素容易被基質(zhì)干擾導(dǎo)致信號(hào)的淬滅。近年來(lái)，隨著商品化的熒光微球的上市，為熒光免疫層析技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有效的工具。熒光微球通過(guò)將大量的熒光物質(zhì)包裹于聚合物材料中，表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，并且能有效防止基質(zhì)對(duì)熒光信號(hào)的干擾，提高了熒光物質(zhì)的光學(xué)穩(wěn)定性[28]。然而由于其顆粒直徑為膠體金顆粒的10～100 倍，這種大直徑的顆粒長(zhǎng)期放置后容易聚集并吸附在結(jié)合墊上，無(wú)法有效地層析。目前常用的策略是將熒光微球標(biāo)記的抗體另外加入于酶標(biāo)孔中，臨用時(shí)手動(dòng)混勻，使用較為不便[29]。本研究將熒光抗體噴在結(jié)合墊上，并置于樣品墊前端（圖2），考察了5 個(gè)配方熒光抗體稀釋液對(duì)試劑有效期的影響（圖5）。配方1為目前較為通用的熒光抗體稀釋液配方，然而將其噴于結(jié)合墊后，熒光信號(hào)大幅度衰減，在配方2加入防腐劑和在配方3加入海藻糖保護(hù)抗體后，雖然結(jié)果有所提高，但仍然不能滿足商品化要求。觀察試紙條后發(fā)現(xiàn)，熒光微球在結(jié)合墊形成了無(wú)法層析的沉淀。配方4加入1%的PVP K-40提高熒光微球的分散性，6 個(gè)月后的熒光信號(hào)大幅度提高。配方4加入了0.2%的精氨酸保護(hù)熒光信號(hào)，使其6 個(gè)月的熒光衰減小于30%，基本滿足商品化條件。

圖5 熒光抗體稀釋液對(duì)熒光信號(hào)衰減的影響Fig. 5 Infl uence of fl uorescent antibody diluents on fl uorescent signal reduction

2.4 方法穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

本研究需用同批次和不同批次（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備）的試紙條對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定，陰性樣品均為未檢出，檢測(cè)添加樣品的結(jié)果見(jiàn)表2。同批次的試紙條6 d內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為11%，不同批次的RSD為16%。回收率均在60%～100%之間，平均回收率為78%，能對(duì)河鲀中的TTX進(jìn)行有效的餐前監(jiān)控。

表2 TTX熒光試紙的批內(nèi)、批間的RSDTable 2 Intra- and inter-assay variations of TTX test strip

2.5 真實(shí)樣品檢測(cè)結(jié)果

表3 2 種方法檢測(cè)河鲀魚(yú)組織中TTX含量（n=6）Table 3 Comparison of TTX contents in puffer tissue determined by two methoddss (n=6)mg/kg

從市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)野生的黑鰓兔頭鲀和養(yǎng)殖的暗紋東方鲀，用本研究建立的熒光免疫層析法和GB/T 23217—2008規(guī)定的液相色譜法對(duì)其肌肉、肝臟、皮中的TTX進(jìn)行檢測(cè)（表3）。在野生黑鰓兔頭鲀的肌肉、肝臟、皮以及養(yǎng)殖暗紋東方鲀的肝臟中，上述兩種方法均檢出TTX。低質(zhì)量濃度下熒光免疫層析法和液相色譜法符合性較好，相對(duì)誤差低于20%（以液相色譜法結(jié)果作為真值），高質(zhì)量濃度下則偏離較大，其原因在于本研究所使用的前處理方法僅使用PBS一步提取，而TTX在PBS中微溶，導(dǎo)致高質(zhì)量濃度下大部分TTX不能轉(zhuǎn)移進(jìn)提取液。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，河鲀魚(yú)有無(wú)毒的判定閾值為1.65 mg/kg，在此閾值附近，熒光免疫層析法的相對(duì)誤差低于30%（以液相色譜法結(jié)果作為真值），而該方法檢測(cè)實(shí)際樣品的RSD小于25%[30]，因此，作為快速初篩方法，該技術(shù)可現(xiàn)場(chǎng)10 min內(nèi)判斷樣品是否有TTX中毒風(fēng)險(xiǎn)。本研究還使用建立的熒光免疫層析法對(duì)沸水浴處理10 min后的野生黑鰓兔頭鲀肌肉進(jìn)行檢測(cè)，仍能檢測(cè)到0.037 mg/kg的TTX，說(shuō)明該方法也可適用于生產(chǎn)和餐飲環(huán)節(jié)熱加工河鲀產(chǎn)品的檢測(cè)。

2016年9月7日，我國(guó)發(fā)布了《關(guān)于有條件放開(kāi)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營(yíng)》的通知，先行放開(kāi)了養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀的加工和銷售。本研究對(duì)養(yǎng)殖的暗紋東方鲀的肌肉、肝臟、皮進(jìn)行了檢測(cè)，僅肝臟檢出微量毒素，但遠(yuǎn)低于中毒風(fēng)險(xiǎn)的閾值?？梢?jiàn)該項(xiàng)政策的出臺(tái)是基于河鲀?nèi)ザ攫B(yǎng)殖技術(shù)已達(dá)到一定水平的背景下做出的，是科學(xué)合理的。然而，河鲀?nèi)ザ攫B(yǎng)殖對(duì)水體、環(huán)境、飼料投放的要求較高，為防止未達(dá)到規(guī)范要求的公司或個(gè)人進(jìn)行河鲀養(yǎng)殖及銷售，對(duì)市售河鲀的風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查仍然不可放松。

3 結(jié) 論

本研究基于抗體親和位點(diǎn)保護(hù)標(biāo)記方法制備的抗TTX-熒光微球，具有親和力好、熒光強(qiáng)度大、批間差異小等優(yōu)點(diǎn)，從而將TTX的檢測(cè)靈敏度提高至原來(lái)的8 倍左右。并且研究了熒光抗體稀釋液配方，使熒光標(biāo)記抗體一體式組裝在測(cè)試卡上6 個(gè)月熒光衰減小于30%，從而使該技術(shù)能夠以測(cè)試卡的形式商品化應(yīng)用。配合簡(jiǎn)單的一步提取前處理方法，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需15 min，且無(wú)需使用大型設(shè)備，從而彌補(bǔ)了河鲀中TTX餐前現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)技術(shù)的短板。

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Microsphere-Based Fluorescence Immunochromatographic Assay for Quantitative Detection of Tetrodotoxin

ZHANG Shiwei, WANG Shifeng, YAO Tianqi, YANG Guowu, LAI Xintian
(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection, Shenzhen 518102, China)

A microsphere-based fluorescence immunochro matographic assay was established for the detection of tetrodotoxin. A binding site prote ction procedure was developed for antibody labeling with fl uorescent microspheres, which prevented damage to the antibody binding site and consequently enhanced the fl uorescence signal. The whole process of binding and separation was effi ciently completed on an affi nity spin column. The sensitivity of the antibody-microsphere conjugate was nine times higher than that prepared by direct labeling. The immunochromatographic assay exhibited a linear range from 2 to 200 ng/mL for the detection of tetrodotoxin (y = -0.15lnx + 0.95, R2= 0.98) with an IC50of 18.4 ng/mL. The limit of detection (LOD) for tetrodotoxin was 10 μg/kg in puffer with an average relative standard deviation ( RSD) of less than 25% (n = 6). The assay method could be applied on heat-processed products without the need for large-scale equipment.The whole analysis process took only 15 min for each sample.

tetrodotoxin; binding site protection; fl uorescent microspheres; immunochromatography

TS207.3

A

1002-6630（2017）20-0312-06

張世偉, 王士峰, 姚添琪, 等. 熒光微球免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)河鲀毒素[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶ 312-317.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046. http∶//www.spkx.net.cn

ZHANG Shiwei, WANG Shifeng, YAO Tianqi, et al. Microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for quantitative detection of tetrodotoxin[J]. Food Scien ce, 2017, 38(20)∶ 312-317. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046. http∶//www.spkx.net.cn

2016-10-08

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCY20150626104807916）

張世偉（1985—），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。E-mail：zsw_8506@163.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046