錢鑫磊 周珊珊 張冬樂 梅 侶 劉 普*

（1合肥一六八中學(xué) 安徽合肥 230601 2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 安徽合肥 230601）

梨炭疽病是嚴(yán)重危害梨樹的一種真菌病害，主要危害果實(shí)，較少危害葉片、枝條，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致枝干枯死、早期落葉和果實(shí)腐爛[1］。近幾年，江西、浙江、安徽、江蘇、福建等南方砂梨產(chǎn)區(qū)因炭疽病造成的早期落葉也非常嚴(yán)重，部分產(chǎn)區(qū)因早期落葉造成的二次開花等致使梨園完全失去產(chǎn)量。目前生產(chǎn)上應(yīng)對(duì)炭疽病的防治策略主要側(cè)重于化學(xué)藥劑防治。常用的化學(xué)藥劑為波爾多液、代森錳鋅、三唑類殺菌劑及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑等[2］。但化學(xué)殺菌劑危害人類健康，農(nóng)藥的使用量的增大，呈現(xiàn)出用藥量與病蟲害不斷遞加的惡性循環(huán)[3］。因此，探求一種新型、安全的手段替代現(xiàn)有的化學(xué)殺菌劑尤為重要。生防菌對(duì)人畜安全、環(huán)境兼容性好，使病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，可有效減少果品中農(nóng)藥殘留量，正逐漸成為生產(chǎn)上抗病的新興力量[4］。

目前，國(guó)內(nèi)、外科研人員已經(jīng)分離篩選一些表型較好的生防芽孢桿菌，Arima等[5］首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可表現(xiàn)出抗病毒、抗支原體和一定程度的抗細(xì)菌活性，Liang等[6］發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌對(duì)葡萄孢菌有較好的抑制作用，其發(fā)酵液對(duì)該菌株的抑制率為 75.8%。但目前尚未發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在梨膠孢炭疽病上的相關(guān)報(bào)道，本文就梨生防菌的分離純化、篩選及16S r DNA菌種鑒定進(jìn)行初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)嫫贩N 碭山酥梨，取自安徽省合肥市高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園果樹實(shí)習(xí)基地。

1.2 供試菌株 膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基 真菌選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、細(xì)菌選用LB培養(yǎng)基、放線菌選用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基。

1.4 菌株分離、純化和培養(yǎng)

1）一年生枝條及葉片內(nèi)生真菌的分離。

表面消毒：將實(shí)驗(yàn)材料用流水沖洗后，轉(zhuǎn)至無菌工作臺(tái)，表面依次用75%酒精消毒1次（20 s）、無菌水漂洗1次。

病健分離：用滅菌手術(shù)刀切取病健交界處，枝條選擇木質(zhì)部，長(zhǎng)約7～8 mm，寬約2～3 mm；葉片選擇病健交界處約邊長(zhǎng)為5 mm的正方形小塊，小心貼置在PDA培養(yǎng)基上，封口后于25℃恒溫培養(yǎng)。

2）一年生枝條及葉片細(xì)菌的分離。將切取的組織依次用75%酒精、無菌水、次氯酸鈉、無菌水、無菌水浸泡3～5 s后，在無菌條件下，加入適量無菌水對(duì)組織進(jìn)行無菌研磨后涂布于LB平板培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后挑取單菌落，接種于4 m LLB液體培養(yǎng)基中，160 r/min、28℃振搖 24 h 備用[7］。

3）土壤中微生物的分離。將取回的土壤稱取2.0 g溶解于100 mL無菌水中，依次將濃度稀釋度調(diào)至 10-1、10-2、10-3、10-4，各取 0.1 mL 用涂布棒均勻涂布于LB平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)[8］。

4）內(nèi)生真菌和細(xì)菌的純化。將分離微生物時(shí)接種的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4～7 d，待組織周圍長(zhǎng)出菌落后，真菌根據(jù)菌落長(zhǎng)出時(shí)間的先后、形態(tài)和顏色，采用菌絲尖端挑取法及時(shí)挑取材料邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不斷純化后置于4℃保存?zhèn)溆茫患?xì)菌、放線菌純化用平板劃線法。

5）生防菌篩選。采用對(duì)峙生長(zhǎng)法檢測(cè)分離得到的所有微生物對(duì)梨膠孢炭疽菌的抑制效果。病原菌膠孢炭疽病菌在PDA培養(yǎng)基、25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，沿菌落邊緣以6 mm滅菌打孔器打出菌餅置于空白PDA平板中心，在距平板邊緣25 mm處呈十字交叉形位置接相同直徑的菌餅，設(shè)空白對(duì)照，對(duì)照菌餅用直徑為6 mm的PDA培養(yǎng)基，每處理重復(fù)3次。待對(duì)照平板菌落將要長(zhǎng)至平板邊緣時(shí)測(cè)各處理菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率（%）＝（對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/（對(duì)照病原菌菌落直徑-6）×100。

6）拮抗放線菌發(fā)酵液的制備。拮抗放線菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，25℃ 200 r/min培養(yǎng)48 h，將放線菌培養(yǎng)液于5 000 r/min離心10 min后，取上清為拮抗放線菌發(fā)酵液，用放線菌過濾器過濾后得到拮抗放線菌無菌發(fā)酵液。

7）常用殺菌劑和生防菌對(duì)病原菌抑菌活性的測(cè)定。在無菌工作臺(tái)配置PDA培養(yǎng)基并滅菌，待溫度降至50°C左右時(shí)按各藥劑推薦使用濃度（80%波爾多液可濕性粉劑400倍液、50%福美雙水分散粒劑700倍液、75%百菌清可濕性粉劑400倍液、3%噻霉酮400倍液）加入相應(yīng)數(shù)量藥劑混勻倒板，加入的生防菌發(fā)酵液濃度為1×109CFU/mL，每個(gè)PDA平板最終培養(yǎng)基體積約10 mL。待培養(yǎng)基冷凝后，采用內(nèi)徑為6 mm的打孔器取相同大小的梨膠孢炭疽菌菌餅，轉(zhuǎn)接到各處理的PDA培養(yǎng)基中心，重復(fù)3次，于25℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，以加入相同體積的無菌水為對(duì)照。每隔24 h觀察記錄一次、測(cè)量各處理菌落直徑，待對(duì)照板長(zhǎng)滿時(shí)測(cè)量并計(jì)算各處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。吸取分生孢子濃度約為1.0×106個(gè)/mL的懸浮液20 μL滴于干凈的凹玻片上，再分別加入殺菌劑推薦使用濃度的2倍液、濃度為1×109CFU/mL的生防菌發(fā)酵液各20 μL，混勻，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)照以無菌水代替殺菌劑。培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)各處理下分生孢子萌發(fā)率[9］。

8）生防菌種屬鑒定。以提取的菌株基因組DNA為模板，采用16S區(qū)通用引物27F/1492R對(duì)獲得的菌株16S片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物27-F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3′；1492-R：5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′。 PCR 反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 90 s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)得的rDNA-16S基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性Blast比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離與篩選 從采集的樣本中共分離到313株，分布比例為病葉、健葉、病枝、健枝、土壤，微生物在土壤、病葉、病枝分布較多。平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示微生物中拮抗能力較強(qiáng)的有3個(gè)，占0.96%；有拮抗能力的有15個(gè)，占4.79%；無拮抗能力的有295個(gè)，占94.25%。拮抗效果最好的為RT-30，因此選擇RT-30做了進(jìn)一步的離體和活體抑菌效果研究（圖1）。

圖1 RT-30對(duì)梨膠孢炭疽病菌的拮抗作用

2.2 生防菌RT-30對(duì)梨炭膠孢疽病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制效果 同時(shí)培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)，RT-30對(duì)炭疽病菌菌絲的抑制效果明顯高于80%波爾多液可濕性粉劑400倍液，接近于400倍液的75%百菌清可濕性粉劑，在前3 d對(duì)炭疽病菌菌絲的抑制效果趨于一致，菌絲在第4～6天幾乎停止生長(zhǎng)，在加入RT-30的培養(yǎng)基中，盡管菌落直徑擴(kuò)大，但菌絲生長(zhǎng)力極弱（圖2）。

圖2 RT-30對(duì)梨膠孢炭疽病菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用

RT-30和不同殺菌劑對(duì)膠孢炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)抑制作用有顯著差異，RT-30的抑制率達(dá)到65.50%，明顯高于抑制率為21.86%的80%波爾多液可濕性粉劑400倍液；通過對(duì)膠孢炭疽病菌分生孢子各處理發(fā)現(xiàn)，3%噻霉酮300倍液處理下的孢子萌發(fā)率為0%，說明該藥劑對(duì)膠孢炭疽菌分生孢子的萌發(fā)起著極為明顯的抑制作用，50%福美雙可濕性粉劑700倍液、75%百菌靈可濕性粉劑400倍液和RT-30對(duì)炭疽病孢子的萌發(fā)一定的抑制效果，均與清水對(duì)照差異顯著（表1）。

表1 殺菌劑與生防菌RT-30對(duì)膠孢炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.3 拮抗細(xì)菌的種屬鑒定 序列比對(duì)結(jié)果顯示，拮抗菌 RT-30的 16S rDNA序列與Bacillus methylotrophicusMo-Bm HQ325853同屬一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)比較可以得出RT-30為Bacillus methylotrophicus。

3 討論

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus是Madhaiyan等[10］自水稻根系土壤中分離得到的芽孢桿菌屬新成員；呂倩等[11］首次從海洋中分離得到，并證實(shí)此菌具備較強(qiáng)抑制黃瓜炭疽病菌等病原真菌活性的能力，有防治作物真菌病害的利用潛質(zhì)；采俊香等[12］在抱莖苦荬菜中分離出了甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，其抗菌蛋白對(duì)番茄早疫病、梨黑斑病和番茄灰霉病具有較好抑制效果，抑菌率分別為 88.3%、90.5%和 95.4%；莊春等[13］在進(jìn)行該菌可濕性粉劑防治水稻細(xì)菌性條斑病的田間藥效試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在濃度為1 800 g/hm2時(shí)，對(duì)此病的病指防效為61.8%，防效極顯著高于50%氯溴異氰脲酸可溶性粉劑。目前，以甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌為主要活性成分的生防制劑（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌9912，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司）已被開發(fā)成產(chǎn)品防治黃瓜灰霉病，并于2015年12月獲得了登記。

本研究離體抑菌結(jié)果表明RT-30具有明顯抑制菌落生長(zhǎng)的活性，通過與普通藥劑比較實(shí)驗(yàn)，顯示RT-30可以抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，因此，具有潛在商業(yè)使用價(jià)值。前人研究顯示甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌具有分泌抗菌性活性物質(zhì)酯肽的能力。酯肽已被證實(shí)具有抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的能力，相比于化學(xué)合成農(nóng)藥，酯肽具有易降解、環(huán)境友好等特點(diǎn)[11－12］。 目前，還未見甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在防治梨樹病害的相關(guān)報(bào)道，本研究明確了甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)梨樹炭疽病的防治作用并與常用藥劑比較了可能的作用機(jī)理，為下一步的抗菌機(jī)制、定殖部位和能力、田間藥效、發(fā)酵和劑型開發(fā)等提供了基礎(chǔ)，也為炭疽病的防治提供了新的思路。