許宗麗，黃溢泓，李志源，劉針伶，周師師，覃艷然，邱 潔，盤美妮

（柳州市動物疫病預防控制中心，廣西柳州 545000）

豬偽狂犬病病毒LAMP可視化檢測方法的建立

許宗麗，黃溢泓，李志源，劉針伶，周師師，覃艷然，邱 潔，盤美妮

（柳州市動物疫病預防控制中心，廣西柳州 545000）

根據GenBank中豬偽狂犬病病毒（PRV）gB基因的保守序列，設計一套特異性引物，在對反應條件進行優(yōu)化后，建立了PRV環(huán)介導等溫擴增（LAMP）可視化檢測方法。結果顯示：該方法能在常規(guī)65 ℃水浴鍋中30 min內實現對目的片段的特異性擴增，并且可通過肉眼觀察顏色直接判定檢測結果；該方法具有很高的特異性，與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型等均無交叉反應；該方法的敏感性可達1 fg；將該方法應用于臨床樣品檢測，結果與普通PCR方法一致。研究表明，本研究建立的LAMP方法簡便、快速、靈敏、特異，適合基層PRV感染的快速檢測。

豬偽狂病病毒；環(huán)介導等溫擴增（LAMP）；檢測

Abstract：According to the sequences of PRV gB gene in GenBank，a set of primers was designed. After the optimization of the reaction conditions，a visualized LAMP for PRV was established. The results showed that the optimized detection assay could be conducted by incubating in the conventional water bath at 65℃ for 30min，and the result could be directly determined by visual observation. The assay was specific to PRV with a detection limit of 1 fg，and no crossreactivity with other pathogens of swine，including CSFV and PCV2. The results of detection of clinical samples by our LAMP approach were consistent with that of the ordinary PCR assay. These results suggested that the LAMP assay described in this study was a simple，rapid，specific method for detection of PRV in the field.

Key words：Pseudorabies virus；LAMP；detection

偽狂犬?。≒R）是一種以急性腦脊髓炎、發(fā)熱以及奇癢（豬除外）等為主要臨床癥狀的急性傳染病，由偽狂犬病病毒（PRV）引起，可危害多種家畜和野生動物[1-2]。豬是PRV的傳染源和自然宿主，感染后表現為發(fā)熱，仔豬還表現神經癥狀和高死亡率，大中豬表現呼吸癥狀，母豬出現流產、產死胎、不育等臨床特征[3]。據鄧仕偉等[4]統(tǒng)計，2006年該病在我國29個省、香港特別行政區(qū)及臺灣發(fā)生。目前，PR的流行出現上升趨勢，成為養(yǎng)豬業(yè)中危害嚴重的疫病之一。

環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是一種新型核酸擴增技術，由Notomi等[5]于2000年研發(fā)成功。它通過識別靶序列上的8個特異區(qū)域和Bst DNA聚合酶在恒溫（60～65 ℃）下形成瀑布式的核酸高效擴增。該技術具有操作簡便、反應快速、成本低廉和結果可視等優(yōu)點，目前被廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲等病原體的檢測[6-10]。為了提高檢測的準確性及其效率、降低檢測成本，本研究所采用LAMP技術對實驗設備和實驗條件要求不高，適合養(yǎng)殖場和基層獸醫(yī)站快速準確檢測的方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MgSO4、Bst DNA聚 合 酶（ 大 片 段）、Betaine，購自New England Biolabs公司；TIANamp血液/細胞/組織 基因DNA提取試劑盒，購自天根公司；RNA提取試劑TRIzol LS Reagent，購自Invitrogen公司。

1.2 病毒株

豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬藍耳病毒（PRRSV）和豬偽狂病毒（PRV-2015）等，由本實驗室分離保存；豬O型口蹄疫病毒（FMDV-O）滅活疫苗，由本單位疫苗室保管。

1.3 引物設計和合成

下載GenBank中的PRV gB基因序列，利用Lasergene軟件進行多序列比對，在保守區(qū)運用在線軟件Primer Ex-plorer V4設計LAMP引物（表1）。引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 LAMP引物序列

1.4 核酸的提取和模板的制備

對PCV-2和PRVDNA的提取，參照TIANamp血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒說書進行；對CSFV、PRRSV、FMDV-O疫苗株的RNA抽提，按照TRIzol LS Reagent使用說明書進行，并進行反轉錄制備cDNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PRV模板標準品的制備：用試劑盒回收B3、F3引物，擴增PRV PCR產物，與pGM18-T載體鏈接，構建標準品重組質粒pGM-PRV；提取質粒，通過紫外分光光度計測定DNA濃度。

1.5 LAMP反應條件的優(yōu)化

對反應體系在如下范圍內進行優(yōu)化：FIP/BIP引物終濃度 1.6 μmol/L、B3/F3 引物 0.2 μmol/L、LF/LB 0.8 μmol/L，Bst DNA 聚 合 酶（8 U/μL）1 μL、10×Bst buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL、Betaine（1 mol/L）1～7 μL、MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL、Calcein（625 μmol/L）、MnCl2（12.5mmol/L）各 1 μL、模板 DNA 1 μL，加水至 25 μL。用水替代模板DNA，設陰性對照管。在水浴鍋中65 ℃反應60 min，12 ℃ 4 min冷卻，多次重復試驗后確定Betaine最佳反應用量。根據Betaine的最佳用量，以上其他反應條件不變，MgSO41～7 μL，多次重復試驗后確定最佳反應用量。根據Betaine、MgSO4的最佳用量，以上其他反應條件不變，將溫度按59 ℃～67 ℃依次遞增，多次重復試驗后確定最佳退火溫度。

1.6 特異性和靈敏度檢驗

利用優(yōu)化好的LAMP反應體系，對CSFV、豬細小病毒（PPV）、PRRSV、PCV-2和FMDV-O的疫苗毒株進行檢測，同時用水替代模板，設陰性對照管，檢驗LAMP方法的特異性；使用Beckman UV-800紫外分光光度計測定PRV的DNA濃度，并按10倍遞增稀釋；對各濃度DNA用LAMP方法進行檢測，同時用水替代模板，設陰性對照管，并用PCR方法進行擴增；按照1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果確定該方法的靈敏度。

1.7 臨床樣品的檢測

對2016年柳州市各養(yǎng)殖場送來的28份豬腦組織樣品同時進行PCR和LAMP檢測，來驗證所建立方法的臨床運用效果。PCR反應體系：2×Taq PCR mix 12.5 μL， 上 下 引 物 F3/B3各0.5 μL，模板 1 μL，補充水至 25 μL。反應程序為：94 ℃ 3 min ，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增的目的片段為gB基因，長度為209 bp。

2 結果

2.1 LAMP反應條件的優(yōu)化

通過對各反應條件的優(yōu)化，最終確定LAMP反應體系為25 μL：FIP/BIP引物終濃度 1.6 μmol/L、B3/F3 引物 0.2 μmol/L、LF/LB 0.8 μmol/L，Bst DNA 聚合酶（8 U/ul）1 μL、10×Bst buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL、Betaine（1 mol/L）5 μL、MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL、Calcein（625 μmol/L）、MnCl2（12.5 mmol/L）各 1 μL、模板 DNA 1 μL（14 ng/μL，加水至25 μL。用水替代模板DNA，設陰性對照管。充分混勻后，在水浴鍋中65 ℃反應30 min，12 ℃4 min冷卻。反應后肉眼可見陽性管溶液變綠，陰性對照管溶液為較淺的桔紅色（圖1-A）；反應液瓊脂糖凝膠電泳后的陽性管呈現出特征性梯形條帶（圖1-B）。

圖1 LAMP方法的優(yōu)化結果

2.2 特異性檢驗

用本研究建立的LAMP方法進行檢測，發(fā)現只有PRV為陽性（肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈現特征性梯形條帶），而CSFV、PPV、PRRSV、FMDV-O（疫苗株）和PCV-2均為陰性（圖2）。

圖2 LAMP方法檢測特異性

2.3 靈敏度檢驗

該方法對PRV的最小檢測限為1 fg（圖3），靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍（圖4）。

2.4 臨床樣品的檢測

在2016年柳州市各養(yǎng)殖場送來的28份腦組織樣品中，用所建立的方法檢測出12份陽性。該結果與普通PCR結果一致，說明LAMP方法可以用于臨床檢測。

圖3 LAMP方法檢測的靈敏度

3 討論

目前，PR在世界多個區(qū)域流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。我國是養(yǎng)豬業(yè)大國，也面臨同樣嚴峻的PR疫情。相關資料表明，我國有50%左右的規(guī)?；i場存在PRV野毒感染，散養(yǎng)戶的感染情況更為嚴重[11。如何防治和凈化PR成為國內養(yǎng)豬業(yè)專家、技術人員及學者共同關注的話題?？焖僭\斷技術在PR的防治中起至關重要的作用。

LAMP技術是新型的核酸擴增技術，不需要特殊的儀器設備，在水浴鍋即可完成。在有熒光染料的條件下，反應結果可肉眼觀察。本研究根據GenBank中PRV gB基因保守序列，優(yōu)化反應條件，建立了PRV LAMP檢測方法。本研究建立的PRV LAMP檢測方法，具有較高的靈敏性，DNA的最小檢測量為1 fg。楊睿等[12]、王樹芬等[13]分別根據PRV gE和DBP基因保守序列建立了LAMP方法。他們建立的體系反應時間均為40 min。本研究根據gB基因建立的方法，只需要在65 ℃等溫條件30 min內就可觀察結果，表明建立的方法更快速。楊睿等[12]、張莉等[14]均選用SYBR Green I為染料，建立了PR可視化檢測方法；王淑芬等[13]用一種新的熒光染料——羅丹明B衍生物作為指示劑。當其由紫色變成藍色時為陽性，因而避免了反應后開蓋加入染料造成的假陽性。本研究使用Calcein+MnCl直接加入反應液中，反應后陽性由桔紅色變?yōu)榇渚G色，更直觀，因此開闊了不同反應指示劑在PR LAMP快速檢測中的應用空間。應用所建立的方法對CSFV、PPV、PRRSV和PCV-2和FMDV-O（疫苗）等5種核酸進行檢測，發(fā)現結果都為陰性。用該方法和PCR方法對28份臨床樣品進行檢測，發(fā)現結果完全一致。這表明所建立的LAMP方法可用于臨床樣品的檢測。此外，所建立的PRV LAMP檢測方法，操作簡單，僅需1臺水浴鍋，通過肉眼觀察顏色變化，便可直接判定結果，適合基層的快速檢測，在PR的診斷和凈化方面具有廣闊的應用前景。

[1]POMERANZ L E，REYNOLDS A E，HENGARTNER C J. Molecular biology of pseudorbies virus：impact on neurovirology and veterinary medicine[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2005，69（3）：462-500.

[2] 殷震，劉景華. 動物病毒學[M]. 北京：北京科學出版社，1997.

[3] 王軍，張秀鳳，王瑞. 河南省豬偽狂犬病流行病學調查[J]. 江蘇農業(yè)科學，2012，40（4）：221-222.

[4] 鄧仕偉，汪勇，薛春芳. 我國偽狂犬病流行現狀及新特點[J]. 動物醫(yī)學進展，2006，27（9）：105-107.

[5] NOTOMI T，OKAYAMA H，MASUBUCHI H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res，2000，28（12）：63.

[6] 羅忠永，王印，楊澤曉. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒LAMP檢測方法的建立[J]. 動物醫(yī)學進展，2016，37（1）：1-5.

[7] MARUYAMA F，KENZAKA T，YAMAGUCHI N，et al. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loop-mediated isothermal amplification[J]. Applied and environmental microbiology，2003，69（8）：5023-5028.

[8] 范晴，謝芝勛，劉加波，等. 牛病毒性腹瀉病毒RTLAMP檢測方法的建立[J]. 生物技術通訊，2010，21（2）：248-251.

[9] KUBOKI N，INOUE N，SAKURAI T，et al. Loopmediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes[J]. Journal of clinical microbiology，2003，41（12）：5517-5524.

[10] ENDO S，KOMORI T，RICCI G，et al. Detection of gp43of Paracoccidioides brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method[J]. FEMS microbiology letters 2004，234：293-297.

[11] 湯丹，張文飛，張鑫雷. 淺談豬偽狂犬病及其防控與凈化[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（11）：137-138.

[12] 楊睿，楊金龍，王孝友，等. 快速診斷偽狂犬病毒的LAMP方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)學報，2011，31（2）：161-164.

[13] 王樹芬，王德國，薛白，等. 可視化LAMP快速檢測豬偽狂犬病毒[J]. 河南農業(yè)科學，2012，41（6）：140-143.

[14] 張莉，鄢明華，王東，等. 豬偽狂犬病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，2011，41（7）：723-727.

（責任編輯：朱迪國）

Establishment of a Visualized LAMP Method for Detection of Pseudorabies Virus

Xu Zongli，Huang Yihong，Li Zhiyuan，Liu Zhenling，Zhou Shishi，Qin Yanran，Qiu Jie，Pan Meini
（Liuzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545000）

S851.3

A

1005-944X（2017）10-0079-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.022

廣西柳州科技項目（2015E040501）

黃溢泓