陶璐(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 421019)

鐵(Ⅱ)配合物的合成與ct-DNA作用的光譜分析

陶璐(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 421019)

設(shè)計(jì)合成一個(gè)鐵(Ⅱ)配合物[Fe(LA)2Br2](LA＝鵝掌楸堿)，以ct-DNA為靶點(diǎn)，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜、熒光光譜和DNA粘度實(shí)驗(yàn)研究了配合物與ct-DNA的鍵合方式。研究表明所合成的配合物與DNA之間存在插入作用和靜電作用。

配合物；ct-DNA；光譜分析；插入作用

鵝掌楸堿是一種典型的異喹啉類生物堿，具有顯著的抗腫瘤、抗病毒、抑菌消炎等活性。鐵元素是人生命體內(nèi)必需的微量元素，尤其是二價(jià)鐵，每個(gè)血紅素都是由卟啉衍生物與鐵(Ⅱ)形成的絡(luò)合物。本文以鵝掌楸堿為配體，與鐵(Ⅱ)離子配位合成配合物[Fe(LA)2Br2](配合物晶體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。以ct-DNA為靶點(diǎn)，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜、熒光光譜和DNA粘度實(shí)驗(yàn)研究了該配合物與ct-DNA的鍵合方式，為研究此類配合物的藥理活性提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 配合物的晶體結(jié)構(gòu)圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見(jiàn)光譜儀；SHIMADZU RF-5301PC熒光光譜儀；Brookfield DV-II pro數(shù)字式旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)；數(shù)顯多功能測(cè)量?jī)x。

鵝掌楸堿；FeBr2；乙醇；十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)于Sigma公司、小牛胸腺DNA(ct-DNA)購(gòu)于華美生物工程公司； GelRed購(gòu)于Biotium公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

Tris-HCl-NaCl緩 沖 液：Tris 0.005 mol/L，NaCl 0.05 mol/L，pH值以鹽酸滴定調(diào)節(jié)至7.35；

BPE 緩 沖 液 ：Na2HPO40.006 mol/L，NaH2PO40.002 mol/L，Na2EDTA0.001 mol/L，pH = 6.99 ；DNA 純 度 ：將適量的ct-DNA溶于Tris-HCl-NaCl 緩沖液中，經(jīng)紫外吸收光譜測(cè)定，在260nm和280nm處的吸光度符合：A260nm/A280nm≈1.8～1.9:1，表明DNA中不含蛋白質(zhì)，因此使用之前不再純化[1]。DNA儲(chǔ)液濃度為2×10-3mol/L；GelRed濃度：將 原 始 的0.018 mol/L的GelRed用Tris-HCl-NaCl緩 沖 液稀釋為1.8×10-3mol/L的溶液；SDS：0.02 mol/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 配合物的合成實(shí)驗(yàn)

稱 取LA(0.05 mmol,0.014 g)和FeBr2(0.05 mmol,0.001 g)加入到一端封閉的25cmPyrex厚壁玻璃管中，往管中滴加0.7mL EtOH和0.3mL H2O，用液氮冷凍后，在抽真空的條件下將開(kāi)口端熔封，混合均勻后置于110℃烘箱中，待其靜置反應(yīng)三天后梯度降溫到室溫，生成大量黑色的菱形塊狀晶體(Yield：90%)。挑選合適的單晶進(jìn)行X-射線衍射分析，確定配合物即[Fe(LA)2Br2]。

(2)配合物的光譜分析實(shí)驗(yàn)

用DMSO作為溶劑將配合物配制2×10-3mol/L的儲(chǔ)備液。紫外-可見(jiàn)光譜滴定分析：將配合物溶液稀釋至2×10-5mol/L。①配合物與ct-DNA的紫外-可見(jiàn)光譜分析，按[ct-DNA]/[配合物]=0、0.1、0.2…1.1的比例依次測(cè)定紫外-可見(jiàn)光譜。②配合物與SDS的紫外-可見(jiàn)光譜分析，按[SDS]/[配合物]=0、0.5、1的比例分別測(cè)其紫外-可見(jiàn)光譜。DNA粘度的測(cè)定：溫度恒定在35℃，配合物儲(chǔ)備液以微量進(jìn)樣器滴加 至ct-DNA的BPE緩 沖 液(1×10-3mol/L，23mL)中，按 照[配合物]/[DNA]= 0、0.01、0.02…0.10的累加比例逐漸滴加，反應(yīng)等量時(shí)間分別記錄η，以配合物的(η/η0)1/3對(duì)([配合物]/[DNA])作粘度分析曲線圖。熒光光譜滴定分析：a.配合物與ct-DNA的熒光光譜分析，配合物溶液稀釋至2×10-5mol/L，按[ct-DNA]/[配合物]=0、1、2…10的比例分別測(cè)其熒光光譜。b.GelRed、配合物與ct-DNA競(jìng)爭(zhēng)性鍵合熒光光譜分析，將[ct-DNA]/[GelRed]比值固定為10：1，按[配合物]/[GelRed]=0：1、1：1、2：1…的比例趨勢(shì)依次加入配合物，觀察隨著配合物濃度的增加熒光曲線的變化，直到熒光曲線飽和。

2 結(jié)果與討論

化合物與DNA作用方式可分為共價(jià)結(jié)合、非共價(jià)結(jié)合和剪切作用三種，其中非共價(jià)結(jié)合主要包括：靜電結(jié)合、溝槽結(jié)合和插入結(jié)合三種形式[2]。

2.1 配合物與ct-DNA的紫外-可見(jiàn)光譜分析

圖2中虛線表示未加入ct-DNA時(shí)配合物的紫外吸收曲線，實(shí)線為隨著ct-DNA加入配合物的紫外吸收曲線。虛線中247nm和269nm處的特征吸收峰歸屬于稠環(huán)共軛體系的π→π*電子躍遷，416nm處的特征吸收峰歸屬于雜環(huán)N和羰基O的n→π*電子躍遷。隨著ct-DNA濃度的逐漸增加，吸收光譜表現(xiàn)出了減色和紅移現(xiàn)象。根據(jù)公式{ [DNA]/(εa-εf)=[DNA]/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)]} 計(jì) 算 配 合 物 與DNA 作用的結(jié)合常數(shù)Kb([DNA]代表DNA的濃度；εa為表觀摩爾吸光系數(shù)；εb為與DNA結(jié)合后的摩爾吸光系數(shù)；εf為配合物的摩爾吸光系數(shù))。通常對(duì)DNA具有較強(qiáng)插入作用的化合物，其和ct-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb＞105mol/L。以[ct-DNA]為x軸，[ct-DNA]/( εa-εf)為y軸 作 圖，線 性 擬 合 得 到Kb=4.08×104mol/L，接近105mol/L。因此可以推斷，配合物與DNA存在插入作用。

2.2 配合物與SDS靜電作用分析

圖3中虛線表示配合物在二次蒸餾水中的紫外吸收曲線，實(shí)線表示隨著SDS加入配合物的紫外吸收曲線。隨著SDS濃度增大，247nm處的紫外吸收光譜出現(xiàn)了減色現(xiàn)象，吸光度由0.66763?降到0.60703?，說(shuō)明配合物與SDS存在著靜電作用，可以推測(cè)配合物與同帶負(fù)電荷的DNA可能存在靜電作用。

2.3 DNA粘度實(shí)驗(yàn)

當(dāng)平面小分子插入到DNA雙鏈相鄰的堿基對(duì)之間時(shí)，堿基對(duì)的間距會(huì)增大。DNA的結(jié)構(gòu)變松弛，相應(yīng)溶液的粘度會(huì)增大。而靜電作用、溝槽鍵合等則不會(huì)引起DNA溶液粘度的增加。所以測(cè)定溶液粘度是檢測(cè)配合物與DNA是否以插入方式結(jié)合最有效的方法[3]。

圖2 配合物與ct-DNA相互作用的紫外光譜

圖3 配合物與SDS的靜電作用圖

圖4中實(shí)心三角形所連曲線是配體LA與ct-DNA作用后的相對(duì)粘度變化曲線，實(shí)心正方形所連曲線是配合物與ct-DNA作用后的相對(duì)粘度變化曲線。隨著配體、配合物的依次加入，ct-DNA溶液的粘度呈現(xiàn)明顯增大的趨勢(shì)。當(dāng)[配合物]/[ct-DNA]=0.1時(shí)，相對(duì)粘度比值(η/η0)1/3=1.1811。由此可以推測(cè)，配合物是以經(jīng)典的插入鍵合方式產(chǎn)生作用。配合物較配體使ct-DNA溶液粘度的增加的強(qiáng)度更高。表明配體LA與金屬配位后，提高了配體LA對(duì)生物大分子DNA的鍵合作用。

2.4 熒光光譜分析

圖5中虛線表示未加入ct-DNA時(shí)配合物的熒光發(fā)射曲線，實(shí)線表示隨著ct-DNA的濃度增大，配合物與ct-DNA作用后的熒光發(fā)射曲線。隨著ct-DNA濃度不斷增大，該發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)明顯的減弱。當(dāng)[ct-DNA]/[配合物]=1時(shí)，配合物在505nm處的最大發(fā)射峰由I=697.419減弱到I=639.351，減色8.3%；當(dāng)[ct-DNA]/[配合物]=10時(shí)，I=412.481，總共減色40.9%。配合物與ct-DNA發(fā)生了插入作用從而熒光強(qiáng)度減弱。

溴化乙錠EB具有共軛芳香平面性結(jié)構(gòu)，其本身幾乎沒(méi)有熒光，但能平行插入雙鏈DNA的堿基之間使本身熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。如果小分子配合物也能與DNA發(fā)生類似的插入作用時(shí)，配合物會(huì)與EB競(jìng)爭(zhēng)與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，會(huì)使EB在DNA的結(jié)合位點(diǎn)部分游離出來(lái)，從而使體系的熒光強(qiáng)度減弱。因此，根據(jù)這一體系的熒光強(qiáng)度變化可初步判斷配合物與DNA的結(jié)合模式[4]。GelRed安全無(wú)毒的優(yōu)勢(shì)使其越來(lái)越廣泛地替代可致癌的EB用于生物化學(xué)分析[5]。

圖6中虛線表示GelRed-ctDNA體系的熒光發(fā)射曲線，實(shí)線表示隨著配合物加入的熒光變化曲線。隨著配合物的濃度增大，配合物在504nm附近產(chǎn)生了很強(qiáng)的熒光發(fā)射，它的增強(qiáng)強(qiáng)度要明顯大于GelRed熒光的減弱程度。[配合物]/[GelRed]=0：1時(shí)，GelRed在590nm處的最大熒光強(qiáng)度為I0=437.015，[配合物]/[GelRed]=5：1 時(shí)，I=198.966，減色54.5%，此時(shí)GelRed熒光減色基本趨于飽和。這表明配合物、GelRed與ct-DNA之間存在著一定程度的競(jìng)爭(zhēng)性鍵合作用，從而證明配合物對(duì)ct-DNA的插入作用。

3 結(jié)語(yǔ)

結(jié)果表明，配合物[Fe(LA)2Br2]由于配體鵝掌楸堿具有良好的平面型結(jié)構(gòu)，能夠以插入鍵合的方式作用于DNA雙鏈的堿基對(duì)間。配合物與SDS存在著靜電作用，可以推測(cè)配合物與同帶負(fù)電荷的DNA可能存在靜電作用。

[1]Marmur J.,et al.Aprocedure for the isolation of deoxyribonucleic acid frommicroorganisms[J].J.Mol.Biol.,1961,3∶208-218.

[2]靳蘭,楊頻,李青山.熒光法研究手性金屬配合物與DNA的作用機(jī)理[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),1996,17∶1345-1348.

[3]S.Satyanarayana,J.C.Dabrowiak,J.B.Chaires,et al.Neither Δ- nor Λ-tris(phenanthroline)ruthenium(II) binds to DNAby classical intercalation[J].Biochem.,1992,31(39)∶9319-9324.

[4]沈景山,孫丹丹,付連春,等.熒光光譜法研究抗癌藥物與DNA的相互作用[J].光譜與光譜分析 ,2005,25(2)∶232-234.

[5]Barton J K,Goldberg J M,Kumar C V，Turro N J．J.Am.Chem.Soc.,1986,108∶2081-2088．

圖4 配體和配合物與ct-DNA作用相對(duì)粘度變化曲線圖

圖5 配合物與ct-DNA相互作用的熒光光譜

圖6 配合物、GelRed與ct-DNA競(jìng)爭(zhēng)性鍵合的熒光光譜

陶璐(1986- )，女，湖南醴陵人，講師，碩士研究生，研究方向：無(wú)機(jī)藥物化學(xué)。