劉 婷， 姚 拓*， 陳建綱， 劉 歡

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程 實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070)

植物激素(Plant Hormones，PHs)是一類(lèi)在植物體內(nèi)含量極少，但在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝等方面具有重要作用的微量有機(jī)化合物[1]。PHs不僅能由植物產(chǎn)生，而且許多細(xì)菌也可以產(chǎn)生諸如生長(zhǎng)素(Auxins，Auxs)、赤霉素(Gibberellins，GAs)、細(xì)胞分裂素(Cytokinins，CTKs)等多種PHs類(lèi)物質(zhì)，從而具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[2]。植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是指存在于植物根際對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的一類(lèi)有益菌[3 - 4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，PGPR不但可以通過(guò)溶磷作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還可以通過(guò)固定大氣中游離態(tài)的氮、拮抗病原微生物、分泌PHs等作用對(duì)植物進(jìn)行促生[5 - 7]?；实倪^(guò)量施用嚴(yán)重地污染了土壤環(huán)境并威脅著生態(tài)平衡，微生物菌肥的研制與開(kāi)發(fā)已成為目前解決化肥問(wèn)題的最佳選擇，PGPR優(yōu)良促生菌資源的篩選是研制PGPR菌肥的最重要的前提。目前對(duì)PGPR的促生特性研究最多的是溶磷及固氮作用，對(duì)其分泌PHs特性的研究鮮有報(bào)道，主要是因?yàn)樵赑Hs的檢測(cè)方面還沒(méi)有一種確定的可以同時(shí)檢測(cè)多種PHs的分離分析方法。因此，確定一種高效的可以用于檢測(cè)PGPR菌株發(fā)酵產(chǎn)物中PHs的分離分析方法，就可以為PGPR優(yōu)良促生菌株資源的篩選提供相關(guān)的技術(shù)參考。

目前，微生物發(fā)酵產(chǎn)物中PHs的含量測(cè)定多采用高效液相色譜法(HPLC)[8 - 10]。由于發(fā)酵產(chǎn)物中PHs含量極低，且干擾雜質(zhì)復(fù)雜，HPLC很難直接檢測(cè)到PHs，因此就需要結(jié)合樣品前處理技術(shù)來(lái)純化基質(zhì)。固相萃取(SPE)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種新型樣品前處理技術(shù)[11 - 13]，該技術(shù)在植物樣品的前處理中已經(jīng)得到了廣泛地應(yīng)用，但是在微生物發(fā)酵產(chǎn)物的前處理方面還鮮有報(bào)道，利用SPE-HPLC對(duì)PGPR發(fā)酵產(chǎn)物中3種典型的PHs的同時(shí)檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)PGPR菌株發(fā)酵產(chǎn)物中吲哚-3-乙酸、赤霉素和玉米素這3種典型的PHs進(jìn)行了測(cè)定，建立了一種可以同時(shí)測(cè)定上述3種PHs的SPE-HPLC法，并在此基礎(chǔ)上篩選出高產(chǎn)PHs的PGPR菌株。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；752PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x(北京華盛譜信儀器有限責(zé)任公司)；Agilent Bond Elut C18 固相萃取柱(500 mg，6 mL)；0.45 μm親水PTFE針式濾器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

吲哚-3-乙酸(Indoleacetic-3-Acid，IAA)、赤霉素(Gibberellin Acid，GA3)和玉米素(trans-Zeatin，t-Z)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于98%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。依據(jù)文獻(xiàn)方法[14]，準(zhǔn)確稱取IAA、GA3和t-Z標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，分別用甲醇溶解并定容至10.00 mL，配制成1.00 g·L-1的儲(chǔ)備溶液，置于-20 ℃的冰箱中避光保存。使用前將儲(chǔ)備液按1∶1∶1的比例混合后，再用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下存放(保質(zhì)期1個(gè)月)。甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)，冰乙酸(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。所有試劑在使用前均用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

供試的10個(gè)PGPR菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供。各菌株的學(xué)名及宿主植物見(jiàn)表1。

表1 供試菌株

* and -:Not identified.

1.2 樣品前處理

將活化好的待測(cè)菌株接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，在避光的條件下置于28 ℃、180 r·min-1的搖床中培養(yǎng)。3 d后將培養(yǎng)基在4 ℃、5000 r·min-1的條件下離心10 min，棄去菌體收集上清液。C18固相萃取柱分別用6 mL甲醇和6 mL 10%甲醇活化，將收集的上清液緩慢注入柱內(nèi)，控制流速1 mL·min-1。待樣品加完，用6 mL 10%甲醇淋洗2次，棄去流出液。最后用5 mL 80%甲醇洗脫2次并收集洗脫液。將洗脫液在室溫下氮?dú)獯蹈?，再用甲醇溶解定容? mL離心管中，保存于4 ℃培養(yǎng)箱中。

1.3 色譜條件

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相采用體積比為2∶3的甲醇-水(含0.2%冰乙酸)二元混合溶劑，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC定量分析方法的建立

圖1 混合激素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外(UV)光譜Fig.1 UV spectra of the mixture of hormones standards

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別掃描標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。繪制紫外光譜圖，如圖1所示。3種植物激素的最大吸收波長(zhǎng)分別為：IAA，220、280 nm；GA3，210 nm；t-Z，215 nm、260 nm?？梢?jiàn)3種組分在波長(zhǎng)為210 nm處都具有比較大的吸收，因此，本研究選擇210 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水為流動(dòng)相。有研究表明，以甲醇-水為流動(dòng)相，在水相中不添加任何添加劑時(shí)，無(wú)論怎樣改變甲醇和水的比例，其色譜圖峰形不好且拖尾嚴(yán)重，如果在此基礎(chǔ)上加入一定量的乙酸，就可以抑制溶質(zhì)的離子化，使分離得到改善[15]。本研究選擇體積比為2∶3的甲醇-水(含0.2%冰乙酸)二元混合溶劑作為流動(dòng)相。

2.1.3流動(dòng)相流速的選擇在植物激素含量測(cè)定的研究中，當(dāng)流速范圍在0.5～2.0 mL·min-1時(shí)，一般設(shè)置為1.0 mL·min-1。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上分別研究了流速為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL·min-1對(duì)激素的出峰時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速增加，分析時(shí)間縮短，但分離度下降，柱壓升高。綜合考慮分析時(shí)間、分離度與柱壓，本研究選擇流速為1.0 mL·min-1。

2.1.4色譜柱柱溫的選擇柱溫分別設(shè)定為20、25、30、35、40 ℃，分析3種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的色譜圖。結(jié)果表明，柱溫對(duì)色譜圖峰形的影響不大，主要影響分離度和保留時(shí)間。溫度升高，色譜峰前移，保留時(shí)間縮短[16]。綜合考慮激素的適宜保存溫度及避免分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本研究選擇30 ℃作為檢測(cè)柱溫。

在選定的色譜條件下，對(duì)混合的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，3種植物激素可以較好地分離和檢出(圖2)。

2.2 方法的線性關(guān)系、檢出限及定量限

圖2 混合激素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of the mixture of hormones standard

將配制的不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2中的方法經(jīng)過(guò)C18固相萃取柱純化富集，并在1.3中已優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度(ng·μL-1)為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并逐步稀釋，以信噪比(S/N)為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的化合物濃度為檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的化合物濃度為定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，3種植物激素在各自的線性范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；3種激素的檢出限在0.08～0.12 ng·μL-1，定量限在 0.13～0.21 ng·μL-1，說(shuō)明該方法有較高的靈敏度。

表2 PHs標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.3 方法的精密度及重復(fù)性

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各自的峰面積，以峰面積為對(duì)象，計(jì)算得IAA、GA3和ZT的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.27%、1.86%和0.95%，表明該方法精密度良好。

隨機(jī)選取一個(gè)菌株按1.2的方法平行制備6份樣品溶液，按1.3的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算各激素的含量，計(jì)算RSD值。3種激素的保留時(shí)間和含量的RSD值均小于3%，表明該測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.4 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

隨機(jī)選取通過(guò)1.2制備好的樣品溶液一份，在1.3的色譜條件下分別于0、2、4、8、12、18、24、32、48、72 h進(jìn)樣測(cè)定。經(jīng)計(jì)算3種激素的保留時(shí)間和含量的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定，儀器穩(wěn)定性良好。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

通過(guò)向發(fā)酵產(chǎn)物樣品中添加激素標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)計(jì)算回收率。精確吸取已知3種激素含量的發(fā)酵液各6份，向其中定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將該混合液按照1.2中的方法經(jīng)過(guò)C18固相萃取柱的純化富集，并按1.3中建立的色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)測(cè)定結(jié)果中3種PHs的測(cè)得量計(jì)算相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。PGPR發(fā)酵產(chǎn)物中PHs的回收率比較穩(wěn)定，在90.30%～104.3%以內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.04%～2.98%之間。結(jié)果表明上述實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，能應(yīng)用于PGPR發(fā)酵產(chǎn)物中3種PHs的同時(shí)分析檢測(cè)。

表3 3種PHs回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.6 PGPR發(fā)酵產(chǎn)物中3種PHs的含量測(cè)定

對(duì)10株P(guān)GPR菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的3種PHs進(jìn)行了定性和定量分析，分析結(jié)果如表4所示。由表4可知，3種PHs的含量差別很大。除菌株003NXZ4以外，其余PGPR菌株發(fā)酵產(chǎn)物中PHs含量均表現(xiàn)為t-Z>GA3>IAA。

綜合分析，菌株P(guān)YXY6、PYXZ6、PLRP2、PHRP2和PBRP5的t-Z含量較高，均大于100.00 ng·μL-1，所以它們可以作為優(yōu)良產(chǎn)t-Z的菌種資源。菌株P(guān)YXZ13、003NXZ4和PYXZ13產(chǎn)生GA3的能力在10個(gè)菌株當(dāng)中相對(duì)較強(qiáng)，所以其可以作為優(yōu)良產(chǎn)GA3的菌種資源。菌株003NXZ4和NXZ9的產(chǎn)IAA的量較多，它們可以作為優(yōu)良產(chǎn)IAA的菌種資源。菌株Lx191、PBRP5、PYXZ6、PHRP2和PLRP2的3種PHs含量變化趨勢(shì)相同，且都能穩(wěn)定產(chǎn)生，因此這5個(gè)菌株可以作為同時(shí)產(chǎn)生3種PHs的優(yōu)良菌種資源。

表4 樣品中植物激素的含量(ng·μL-1)

*Data presented are in means±standard deviation(n=3).

3 結(jié)論

本研究以10株P(guān)GPR菌株為研究對(duì)象，分析檢測(cè)其發(fā)酵產(chǎn)物中3種PHs的含量，建立了一種快速有效的同時(shí)檢測(cè)IAA、GA3和t-Z的高效液相色譜法。結(jié)果表明，3種PHs在其線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，分析時(shí)間短，有機(jī)溶劑消耗較少，既降低了成本，又減少了環(huán)境污染。該方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度，檢出限低，可以作為PGPR發(fā)酵產(chǎn)物中IAA、GA3和t-Z同時(shí)檢測(cè)的常規(guī)分析方法。與此同時(shí)，篩選出高產(chǎn)植物激素的PGPR菌株，為豐富菌種資源庫(kù)和研制微生物菌肥提供了理論依據(jù)。