李 錦， 張麗君， 董南巡， 高仕謙， 顧海東， 張占恩

(1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009； 2.蘇州科技大學(xué)江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215009； 3.江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇蘇州 215009)

環(huán)境雌激素是一類可擾亂人體及動(dòng)物正常生命活動(dòng)的環(huán)境污染物[1 - 2]，有研究表明女童性早熟，婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升和男性前列腺癌均與雌激素的殘留有關(guān)[3 - 4]。近年來，雌激素在污水、地表水、甚至于飲用水水源、自來水廠出水以及配水管網(wǎng)中被多次檢出。因此，測(cè)定環(huán)境水樣中痕量雌激素十分重要。常用的富集雌激素的樣品預(yù)處理方法有固相萃取[5]、基質(zhì)固相分散萃取[6]、分散液相微萃取(DLLME)[7]等。目前，有關(guān)雌激素的樣品預(yù)處理方法以固相萃取為主[8]，而固相萃取較為耗時(shí)、耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑。DLLME是近年發(fā)展起來的一種新型樣品前處理技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、裝置簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但是DLLME多用鹵苯、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳等毒性較大的含鹵萃取劑[9]。Leong和Huang等[10]在DLLME的基礎(chǔ)上于2008年提出一種新型分散液相微萃取技術(shù)，即懸浮固化分散液相微萃取(DLLME-SFO)，該技術(shù)是將分散液相微萃取和懸浮固化液相微萃取兩種技術(shù)結(jié)合[11]，并且優(yōu)于這兩種前處理方法[12]。懸浮固化分散液相微萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水中氯酚[13]、有機(jī)氯農(nóng)藥[14]、金屬銅[15]等的測(cè)定。

本文選用對(duì)人和環(huán)境危害較小的綠色環(huán)保不含氯元素的長(zhǎng)鏈脂肪醇作為萃取劑，同時(shí)以中性離子表面活性劑作為分散劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文所建立的懸浮固化分散液相微萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(DLLME-SFO-HPLC-MS/MS)能快速高效的檢測(cè)環(huán)境水樣中的雌激素殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，TSQ Quantum Ultra EMR三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，Thermo)；800型離心機(jī)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Sk-1型快速混勻器(金壇市科析儀器有限公司)；KQ-100E型超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品壬基雌酚、雙酚A、己烯雌酚、雌酮、雌二醇、雌炔醇均購(gòu)自于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，純度均大于98.0%，用甲醇配成100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于冰箱中4 ℃下保存。1-十二醇、十一醇、2-十二醇、正十六烷均購(gòu)自于上海阿拉丁試劑有限公司，純度均大于99.0%。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、曲拉通 X-100(Triton X-100)、司班20(Span 20)、吐溫80(Tween80)，乙酸、乙酸鈉，氯化鈉均為分析純。色譜純甲醇、乙腈均購(gòu)自于美國(guó)Tedia。實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-C18反相色譜柱(50×3.0 mm，1.8 μm)；流速300 μL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0.0～4.0 min，20～90%B；4.0～7.0 min，90%B；7.0～7.5 min，90～20%B；7.5～10 min，20%B。

采用加熱電噴霧負(fù)離子源(H-ESI)，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)。噴霧器電壓為3 kV，噴霧器溫度為300 ℃，鞘氣和輔助氣壓力分別為172 kPa和69 kPa，離子傳輸毛細(xì)管溫度為350 ℃，碰撞氣壓力為0.2 Pa，進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣。質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 6種雌激素的母離子、子離子和碰撞能量

*quantitative ion.

1.3 萃取過程

吸取10 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后的環(huán)境水樣，置于帶塞玻璃離心管中，調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，再加入萃取劑1-十二醇90 μL和分散劑Triton X-100 250 μL的混合溶液至離心管中，超聲3 min形成乳化溶液，4 000 r/min下離心，分層，得1-十二醇上層萃取相。萃取完成后，將離心管置于4 ℃的冰箱中，冰浴10 min后取出，待凝固點(diǎn)為24 ℃的1-十二醇凝結(jié)成固體，用特制的小勺將其取出并置于進(jìn)樣瓶中，最后加入甲醇溶解定容至300 μL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾至內(nèi)置內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，取10 μL進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取劑的選擇萃取劑的類型對(duì)于DLLME-SFO的萃取率具有顯著性影響。由于雌激素的辛醇/水分配系數(shù)較高，使其更易溶于長(zhǎng)鏈醇(烷)類，適于用DLLME-SFO方法進(jìn)行富集。本文試驗(yàn)了1-十二醇、十一醇、2-十二醇、正十六烷作為萃取劑，考察萃取效率，結(jié)果如圖1所示。 以1-十二醇作為萃取劑時(shí)雌激素的回收率較好。由于1-十二醇與雌激素氫鍵作用較強(qiáng)，增強(qiáng)了其與雌激素作用，因此選擇1-十二醇作為萃取劑。

2.1.2分散劑的選擇表面活性劑同時(shí)具有親水和親油基團(tuán)，能起到分散作用且毒性比常用分散劑要低，本文選用陽離子表面活性劑 CTAB和TTAB、陰離子表面活性劑SDS和中性離子表面活性劑Triton X-100、Span 20和Tween 80作為分散劑。由圖2可知，分散劑為Triton X-100時(shí)，萃取效果較好。雌激素具有弱極性，因此中性離子表面活性劑對(duì)雌激素具有較好的萃取作用。

2.1.3萃取劑和分散劑體積及萃取時(shí)間的選擇采用正交試驗(yàn)法，選擇L16(34)，按照三因素四水平實(shí)驗(yàn)安排，考察三因素1-十二醇體積、Triton X-100體積、萃取時(shí)間；四水平中1-十二醇體積分別為60、75、90、105 μL；Triton X-100體積分別為150、200、250、300 μL；萃取時(shí)間分別為1、3、5、7 min，進(jìn)行條件選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)萃取劑1-十二醇用量為90 μL、分散劑Triton X-100體積為250 μL、萃取時(shí)間為3 min時(shí)萃取效果最好。

圖1 萃取劑類型對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effect of extractants on extraction efficiency Dispersive solvent:200 μL 0.025 mol/L Triton X-100;Extractant volume:100 μL;Salt:5%;pH=6.0;Ultrasonic time:5 min;Centrifugation time:7 min.

圖2 分散劑種類對(duì)萃取效率的影響Fig.2 Effect of dispersants on extraction efficiency Extractant:100 μL 1-dodecanol;Dispersive solvent:200 μL 0.025 mol/L;For other conditions,seeFig.1.

圖3 pH值對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction efficiency Extractant:90 μL 1-dodecanol;Dispersive solvent:250 μL Triton X-100(0.025 mol/L);pH=7.0;Ultrasonic time:3 min;Centrifugation time:7 min.

2.1.4水相的pH和離子強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境水樣pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)進(jìn)行考察。由圖3可知：水樣pH值在7.0左右時(shí)，萃取效果最好，原因是溶液pH值小于目標(biāo)物pKa值三個(gè)單位時(shí)[16]，目標(biāo)物主要以中性分子形式存在，利于萃取，而6種雌激素pKa值在9.5～10.8[17]之間，正好符合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

適宜的離子強(qiáng)度能使待測(cè)物更好的溶于萃取劑中，從而提高萃取率。考察了NaCl濃度分別為0%、5%、10%、15%、20%時(shí)的萃取回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不加鹽時(shí)回收率最高，原因是6種雌激素均含有酚羥基，具有一定電離能力，而NaCl的加入穩(wěn)定了這種電離能力，因而降低萃取效率。

2.2 線性關(guān)系、檢出限、加標(biāo)回收率

用甲醇稀釋雌激素配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按上述1.3重復(fù)操作，用超純水代替水樣，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x，μg/L)為橫軸，相應(yīng)的待測(cè)物峰面積(y)為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性范圍、線性方程、線性相關(guān)系數(shù)(r)，檢出限(LOD)按信噪比(S/N)=3計(jì)算，定量限(LOQ)按S/N=10計(jì)算。在金雞湖(水樣1)和陽澄湖(水樣2)中分別添加高、中、低三種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)添加水平樣品重復(fù)測(cè)定6次，得出回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表2。

表2 6種雌激素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、加標(biāo)回收率

(續(xù)表2)

EstrogenLinear range(μg/L)Linear equationrLOD(μg/L)LOQ(μg/L)Spiked(μg/L)Sample water 1Recovery(%)RSD(%,n=6)E20.05-50y=1445.2x+175.030.99980.0120.036598.12.32595.94.45099.22.4EE20.1-50y=758.79x+356.640.99970.0240.072597.31.92599.07.05099.83.3

2.3 與其它方法的對(duì)比

通過與其它前處理和檢測(cè)方法作比較，可以看出DLLME-SFO萃取時(shí)間較短，回收率較高，檢出限較低，如表3所示。

表3 不同文獻(xiàn)中的雌激素測(cè)定結(jié)果的對(duì)比

2.4 環(huán)境水樣分析

利用該方法對(duì)蘇州市金雞湖和陽澄湖水實(shí)際樣品進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，金雞湖水中含有壬基雌酚濃度為0.15 μg/L、雙酚A濃度為0.02 μg/L、雌酮濃度為0.01 μg/L。結(jié)果見圖4。陽澄湖水中含有壬基雌酚濃度為0.20 μg/L、雙酚A濃度為0.04 μg/L、己烯雌酚濃度為0.42 μg/L、雌酮濃度為0.12 μg/L。

圖4 金雞湖水樣中3種雌激素Fig.4 Three estrogens in Jinji lake

3 結(jié)論

本文建立了懸浮固化分散液相微萃取結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定自然水體中6種痕量雌激素的方法。懸浮固化分散液相微萃取技術(shù)應(yīng)用范圍較廣，所用分散劑為表面活性劑，用量較少，對(duì)環(huán)境污染較小。該方法裝置簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，溶劑用量較少，能快速高效測(cè)定環(huán)境水樣中殘留的雌激素。