張存款，林華*，滿向甜，張學洪，陳俊

氮肥形態(tài)對李氏禾富集銅的影響及生理響應

張存款1,2，林華1,2*，滿向甜1,2，張學洪1,2，陳俊1,2

1. 桂林理工大學//廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室，廣西 桂林 541004；
2. 桂林理工大學//巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 桂林 541004

土壤重金屬污染是環(huán)境和生態(tài)領(lǐng)域研究的熱點及難點。超富集植物受到土壤各種特性的影響，需要采取強化措施來提高植物修復效率。該文旨在加深對李氏禾（Leersia hexandra Swartz）累積銅的認知，為植物修復銅污染土壤提供理論數(shù)據(jù)。在土壤中銅污染水平分別為低（100 mg?kg-1）、中（300 mg?kg-1）、高（500 mg?kg-1）時，研究不同氮肥(NH4)2SO4、CO(NH2)2、Ca(NO3)2、NH4NO3處理對超富集植物李氏禾累積銅、植物生長的影響以及生理響應，氮肥按肥土質(zhì)量比 0.3‰以水溶液的形式每周添加1次，李氏禾生長兩個月后，收獲，進行植株分析。結(jié)果表明：在土壤銅污染水平為500 mg?kg-1時，施加Ca(NO3)2后李氏禾根、莖、葉中的銅富集量達到最大，分別為6167.15、1251.99和975.92 mg?kg-1，約為對照處理組的2.5～4.0倍，相對于其他各氮肥處理和對照組差異達顯著。在低、中、高 Cu污染水平下，施加(NH4)2SO4處理組李氏禾株高均顯著高于其他處理組，分別為68.5、65.2和65 cm；CO(NH2)2組李氏禾生物量分別為12.75、13.45和11.63 g?10 plants-1；葉綠素質(zhì)量濃度分別為24.139、22.615、23.752 mg?L-1；可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為21.704、23.506和20.940 mg?g-1；金屬硫蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為9131.06、10014.02和11018.04 pg?g-1，均高于其他處理組；而NH4NO3處理組李氏禾葉片中丙二醛（MDA）物質(zhì)的量濃度最少，分別為0.893、0.957和0.859 μmol?L-1，有效地緩解了銅對李氏禾的損傷。因此，適量施加氮肥可以有效提高李氏禾的生物量以及根、莖、葉各部分銅累積量，增強了李氏禾對銅污染土壤的修復效果。

銅；李氏禾；生理響應；氮肥形態(tài)

李氏禾（Leersia hexandra Swartz）廣泛地分布于中國南部（張學洪等，2006），是在中國境內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)的濕生鉻超富集植物，具有繁殖快、單位面積生物量大以及可以高密度的生長的特點，適合在水生和潮濕的環(huán)境下生長，為重金屬污染水體和土壤的植物修復提供了寶貴的資源（張學洪等，2008；陶笈汛等，2010）。試驗發(fā)現(xiàn)李氏禾對于銅同樣具有超富集吸附效果（張學洪等，2005；陳俊等，2008）。施肥是農(nóng)藝活動中提高土地肥力和作物產(chǎn)量的重要措施（Wu et al.，2004；沈麗波等，2010）。Fayiga et al.（2008）研究發(fā)現(xiàn)，施肥同樣是提高超積累植物修復污染土壤效率的重要輔助方法。施加氮肥可以改變重金屬在土壤中的形態(tài)和活性，適量施肥可以顯著提高植物的生物量，避免生物稀釋效應，從而增加植物體內(nèi)的重金屬累積總量（王林等，2008；Xie et al.，2009）。本研究通過施加不同形態(tài)的氮肥，探討其對李氏禾銅累積可能產(chǎn)生的影響，旨在為氮肥輔助李氏禾富集重金屬，修復污染土壤的應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物與土壤

供試李氏禾采自桂林市雁山鎮(zhèn)的田埂邊，未受到污染。土壤采自桂林市雁山鎮(zhèn)雁園附近的水稻田，土壤基本理化性質(zhì)：有機質(zhì)0.83%，陽離子交換量 12.1 cmol?kg-1，速效鉀 96.4 mg?kg-1，堿解氮150 mg?kg-1，速效磷 9.3 mg?kg-1，pH 6.4。

1.2 試驗設計

在溫室條件下進行土培盆栽試驗，選取長勢一致的李氏禾幼苗移栽到供試試驗盆中穩(wěn)定1周，土壤底肥磷和鉀分別以KH2PO4和K2SO4形式施入，K和P施用量均為0.13 g?kg-1，氮肥的施入形態(tài)分別為(NH4)2SO4、CO(NH2)2、Ca(NO3)2、NH4NO3，氮肥按肥土質(zhì)量比 0.3‰以水溶液的形式每周施加1次，并設不添加氮肥作為對照組。土壤銅含量按照低污染水平（L，100 mg?kg-1），中污染水平（M，300 mg?kg-1）和高污染水平（H，500 mg?kg-1）添加，混勻后溫室條件下穩(wěn)定2周后，定量稱取2.5 kg土裝入備好的塑料盆中，每盆移栽20～30株李氏禾，每個處理設有3個平行，李氏禾生長過程中使用自來水澆灌，盆栽土壤保持含水量 50%～60%，生長60 d后，收獲李氏禾并進行植株分析。

1.3 研究方法

將李氏禾樣品從盆中連根移出，清理掉附著在根系表面的土壤，使用自來水沖洗干凈，再用 0.1 mol?L-1的Ca(NO3)2溶液浸泡30 min洗去表面的重金屬，然后用去離子水沖洗3次，最后用吸水紙把表面水吸干，將李氏禾分開為根、莖、葉三部分。于105 ℃烘箱中殺青30 min，80 ℃烘干至恒重，粉碎備用。采用HNO3-HClO4濕法消解，用ICP-OES測定李氏禾根、莖、葉中銅含量。

生理響應：測定葉綠素（Cho et al.，1999）和蛋白質(zhì)（福林-酚試劑法）含量；測定李氏禾植株體內(nèi)丙二醛（硫代巴比妥酸比色法；王曉維等，2014）和金屬硫蛋白（MT，酶聯(lián)免疫法）。

采用 SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析（ANOVA）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗（p＜0.05）。運用Origin 9.0進行作圖。

2 結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 不同氮肥形態(tài)對李氏禾株高和生物量的影響

株高和生物量是反映植物對重金屬耐性的重要指標。與對照組相比，各氮肥處理對李氏禾的株高（圖1）和生物量（圖2）均有顯著的作用。低、中、高銅污染水平土壤均以(NH4)2SO4處理組的李氏禾株高和CO(NH2)2處理組李氏禾的生物量最大，分別達到了68.5、65.2和65 cm，12.75、13.45和11.63 g?10 plants-1。高、中和低銅污染水平間株高和生物量差異均不顯著。但隨土壤重金屬污染水平的增加，李氏禾的株高和生物量都呈下降趨勢，說明李氏禾的生長受到重金屬毒害的影響。

與對照組相比，施用氮肥的李氏禾株高均存在顯著性差異（P＜0.05），而(NH4)2SO4和 CO(NH2)2之間、Ca(NO3)2和NH4NO3之間的株高差異性不顯著（P＞0.05），其余氮肥組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。各氮肥處理組的生物量相對于對照顯著（P＜0.05），且各組間的差異性均達到顯著水平，其中(NH4)2SO4、Ca(NO3)2和NH4NO3處理組間的生物量差異性達到極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 不同氮肥處理李氏禾的株高Fig. 1 Plant height of L. hexandra with different nitrogen treatment

圖2 不同氮肥處理李氏禾的生物量Fig. 2 Biomass of L. hexandra with different nitrogen treatment

2.2 不同氮肥形態(tài)對李氏禾富集銅的影響

李氏禾收獲后，測定其根、莖、葉的重金屬含量，分別如圖3、圖4、圖5所示。施用Ca(NO3)2處理的李氏禾對重金屬銅的富集最高，在土壤銅污染水平為500 mg?kg-1時，李氏禾根、莖、葉中銅質(zhì)量分數(shù)分別為 6167、1252、976 mg?kg-1。Ca(NO3)2組李氏禾地下和地上部分銅富集量均高于對照和其他氮肥組，且差異性顯著（P＜0.05）。

從圖3、圖4、圖5可進一步看出，無論土壤施用何種形式的氮肥，李氏禾根吸銅量遠遠高于地上部吸銅量，表明在該試驗條件下，李氏禾均可吸收銅并將其儲存于根部。隨著金屬銅污染水平的增大，李氏禾吸附銅的轉(zhuǎn)運系數(shù)呈下降趨勢（表1），說明金屬濃度影響了金屬銅由地下向地上部分的轉(zhuǎn)運，因為植物修復主要通過收割地上部實現(xiàn)，所以氮肥形態(tài)如何促進重金屬Cu向李氏禾的地上部分轉(zhuǎn)運需進一步研究。

圖3 不同氮肥處理李氏禾根部Cu含量Fig. 3 Cu concentration in root of L. hexandra with different nitrogen treatment

圖4 不同氮肥處理李氏禾莖部Cu含量Fig. 4 Cu concentration in stem of L. hexandra with different nitrogen treatment

2.3 不同氮肥形態(tài)對李氏禾富集銅的生理響應

收獲后，測定李氏禾葉綠素、丙二醛（MDA）、蛋白質(zhì)以及金屬硫蛋白，結(jié)果分別如圖 6、圖 7、圖8和圖9所示。

圖5 不同氮肥處理李氏禾葉部Cu含量Fig. 5 Cu concentration in leaf of L. hexandra with different nitrogen treatment

圖6 不同氮肥處理李氏禾葉片葉綠素的含量Fig. 6 The content of chlorophyll in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

如圖6所示，施用CO(NH2)2組李氏禾葉綠素含量在所有處理組中最高。這是因為氮是葉綠素的重要組成元素，CO(NH2)2中氮含量最高，更加有利于李氏禾進行光合作用以及合成葉綠素。在低、中、高Cu污染水平下，相對于對照組，CO(NH2)2組李氏禾葉綠素含量分別提高了 104.69%、85.73%和72.03%；相對于 Ca(NO3)2組，CO(NH2)2組李氏禾葉綠素含量分別提高了37.28%、28.15%和34.53%，且與其他各組的差異性達到極顯著水平（P＜0.01），這一點與李氏禾的生物量類似。Ca(NO3)2中氮含量最少，相應的葉綠素含量也最少，且與其他氮肥組差異達顯著水平（P＜0.05）。氮肥對李氏禾葉綠素的作用效果為：Ca(NO3)2＞(NH4)2SO4＞ CO(NH2)2＞NH4NO3。

如圖7所示，對照組李氏禾細胞受到的損傷更大，與其他各氮肥組相比差異達極顯著水平（P＜0.01）；NH4NO3處理組李氏禾受到的損傷最小，在低、中、高Cu污染水平下，與對照組相比，李氏禾丙二醛含量分別降低了 41.94%、39.75%和47.50%，有效緩解了重金屬銅對李氏禾的損傷。3種污染水平下，(NH4)2SO4處理組李氏禾丙二醛含量相對于對照組分別降低了 19.23%、13.89%和18.37%，CO(NH2)2、Ca(NO3)2處理后，雖然一定程度緩解了銅對李氏禾的毒害，但效果有限，介于NH4NO3和(NH4)2SO4之間。

表1 不同氮肥處理李氏禾轉(zhuǎn)運系數(shù)Table 1 Translocation factors of L. hexandra with different nitrogen treatment

圖7 不同氮肥處理李氏禾葉片中的丙二醛Fig. 7 The content of MDA in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

圖9 不同氮肥處理李氏禾葉中的金屬硫蛋白Fig. 9 The content of MT in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

如圖8所示，各氮肥處理組可溶性蛋白質(zhì)含量均與對照組存在極顯著差異（P＜0.01），CO(NH2)2組李氏禾蛋白質(zhì)含量在所有處理組中最高，和葉綠素的研究結(jié)果類似。在低、中、高Cu污染水平下，相對于對照組，李氏禾蛋白質(zhì)含量分別提高了 56.07%、68.14%和49.79%；而(NH4)2SO4處理組李氏禾可溶性蛋白的促進作用最小，相對于空白對照組，分別提高了29.11%、33.92%和16.26%。Ca(NO3)2與NH4NO3處理組效果則處于以上兩者之間，且隨著銅污染水平的增加，均出現(xiàn)了先升后降的變化趨勢。

圖8 不同氮肥處理李氏禾葉中的蛋白質(zhì)Fig. 8 The content of protein in L. Hexandra leaves with different nitrogen treatment

如圖9所示，各氮肥處理組金屬硫蛋白含量均與對照組存在顯著性差異（P＜0.05），CO(NH2)2組李氏禾金屬硫蛋白含量在所有處理組中最高。在低、中、高Cu污染水平下，相對于對照組，CO(NH2)2組李氏禾金屬硫蛋白含量分別提高了 32.19%、34.52%和42.53%，和蛋白質(zhì)、葉綠素的研究結(jié)果類似；NH4NO3處理組李氏禾金屬硫蛋白相對于對照組分別提高了9.00%、13.46%和15.78%，但隨著重金屬銅污染水平增加，李氏禾所含的金屬硫蛋白的含量也呈增加趨勢。

3 討論

與對照組相比，氮肥處理李氏禾株高均存在顯著性差異，(NH4)2SO4處理組李氏禾株高和CO(NH2)2處理組李氏禾生物量最大。隨著土壤 Cu污染水平增加，李氏禾株高和生物量都呈下降趨勢，說明李氏禾的生長受到重金屬毒害的影響。幾種氮肥相比，尿素 CO(NH2)2的含氮量最高（46.67%），最有利于光合作用，故生物量也最大。而硫酸銨中除含有氮外，還含有25%硫，而硫作為一種重要的肥料，可能也是導致李氏禾株高大于其他各組的原因。李蓮芳等（2013）發(fā)現(xiàn)了不同形態(tài)氮肥的施用均顯著促進了小白菜（Brassica chinensis）植株的生長，增幅為104.5%～ 224.3%。

氮肥加入土壤后改變了土壤 pH，土壤吸附的重金屬發(fā)生解吸，易于植物對重金屬的吸收。添加氮肥后，植物在吸收 NH4+和 NO3-的同時，根系會分泌 H+和 OH-，致使李氏禾根系周圍呈酸性或堿性。(NH4)2SO4造成根際土壤酸化，施用 Ca(NO3)2造成根際土壤堿化，NH4NO3使根際土壤保持中性，而 CO(NH2)2水溶液呈弱堿性。Ca(NO3)2處理促進李氏禾從土壤中吸收更多的活性銅，而鈣是構(gòu)成細胞壁的重要元素，它與蛋白質(zhì)分子相結(jié)合，是質(zhì)膜的重要組成成分，田靜等（2014）發(fā)現(xiàn)李氏禾對Cu的吸收與鈣離子通道密切相關(guān)。(NH4)2SO4處理抑制了李氏禾從土壤中吸收活性銅，CO(NH2)2和NH4NO3處理組李氏禾吸附的銅則處于以上兩者中間，這跟 Zhang et al.（2009）和 Wang et al.（2004）的研究結(jié)果基本一致。施用氮肥對土壤中銅含量的降低有顯著影響，提高了東方山羊豆（Galega orientalis）的銅累積量（Symanowicz et al.，2015）。李氏禾根系對銅的吸收依靠主動運輸機制，ATP酶抑制劑和低溫處理均能顯著地抑制李氏禾根系對銅的吸收（田靜等，2014）。施肥、植物激素以及螯合劑，都對植物生長發(fā)育及其對土壤中重金屬的吸收具有顯著影響（周建民等，2007；衛(wèi)澤斌等，2015；王平等，2013）。同樣，IAA和EDTA處理能夠促進李氏禾生長發(fā)育，有效緩解土壤Cu對李氏禾的脅迫作用，并顯著增加了李氏禾地上部分Cu的含量（梁亮，2016）。本試驗中所施加的各種氮肥對于李氏禾富 集 銅 的 促 進 效 果 為 ： Ca(NO3)2＞(NH4)2SO4＞CO(NH2)2＞NH4NO3。

重金屬對植物光合作用的抑制機理是重金屬阻礙光合電子的傳遞，抑制質(zhì)體醌和類胡蘿卜素的合成，同時重金屬引起植物葉片氣孔關(guān)閉導致CO2濃度不足。植物進行光合作用后會釋放氧氣，而這一反應過程被認為是過氧化物的一個重要來源，因此研究葉綠體對抗氧化脅迫的響應，同樣是研究李氏禾在重金屬銅脅迫下的生理響應。王平榮等（2009）認為，氮和鎂作為葉綠素組成的重要成分，其缺少時會影響葉綠素的形成。葉片中葉綠素含量的高低直接關(guān)系著光合作用的強弱，同時植物的生長和生物量的增加都有賴于植物的光合作用。Ca(NO3)2中氮含量最少，相應的葉綠素含量也最少，但是其銅富集量最大，可能是因為Cu脅迫抑制了李氏禾對氮的吸收，從而減少了葉綠素的合成。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷（劉俊祥等，2015；王曉維等，2014），丙二醛（MDA）含量的升高可能與植物組織中ROS的大量積累有關(guān)，ROS含量的增加不僅威脅植物的生長發(fā)育，同時還能增強脂質(zhì)過氧化作用。植物體中MDA含量越高，表明脂質(zhì)過氧化作用程度越激烈，對細胞的損傷就越大。張杏鋒等（2017）發(fā)現(xiàn)隨著金屬濃度的增高，膜脂過氧化作用加劇，對植物造成的傷害程度增大。說明脂質(zhì)過氧化作用在高濃度Cu脅迫下變得激烈，對李氏禾細胞造成了巨大的損傷。施加氮肥不僅提高了李氏禾對金屬銅的耐受性，增強其Cu富集能力，同樣緩解了李氏禾葉片的損傷，這一點與李氏禾的株高和生物量表現(xiàn)類似。

可溶性蛋白質(zhì)是植物體重要的生理生化指標，是細胞中最重要的含氮大分子之一，其含量是了解植物體中總代謝的重要指標，也可以用來衡量是否發(fā)生重金屬脅迫。氮素對植物生長發(fā)育的影響是十分明顯的。當?shù)爻渥銜r，植物可合成較多的蛋白質(zhì)，可促進細胞的分裂和增長，因此植物葉面積增長快，更有利于光合作用。隨著金屬銅污染水平增加，可溶性蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了先升高后下降的變化，中濃度Cu可引起可溶性蛋白質(zhì)含量應激性升高，高濃度時下降，主要是由于Cu脅迫時間過長，植株體受到損害（關(guān)夢茜等2014）。Cu誘導植物體內(nèi)活性氧的大量積累，而后進一步破壞蛋白質(zhì)的氨基酸殘基，引起大量蛋白質(zhì)的功能喪失。而氮肥處理組李氏禾葉片中可溶性蛋白質(zhì)均超過對照組，可能與光合效率的提高存在協(xié)同作用。

金屬硫蛋白（MT）是分子量較低且富含半胱氨酸的一類蛋白質(zhì)，能結(jié)合多種金屬，在植物對重金屬的解毒機制中有著重要的作用。MT的作用形式通常與其清除ROS的能力有關(guān)，MT還能通過巰基與金屬離子結(jié)合，改變生物體內(nèi)重金屬的活性，從而降低重金屬離子的毒性。MT的過度表達通常能提高植物對重金屬的耐受性，在Yang et al.（2009）和Sekhar et al.（2011）的研究中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）植物通過CcMT1的過度表達來增強植物對Cu和Cd的耐受性。葉片中產(chǎn)生的MT在抵御Cu脅迫中起著重要的保護作用，不同氮肥對李氏禾的MT含量的促進效果不同，可能跟其誘導MT的表達反應有關(guān)，MT含量的增加，提高了李氏禾對銅的耐性。

4 結(jié)論

施用不同氮肥能明顯提高Cu污染土壤上生長的李氏禾生物量，其中以施用 CO(NH2)2的效果最為明顯。氮肥的施用對李氏禾吸附銅有促進作用，施用 Ca(NO3)2的植株地上部和根吸收銅量均高于施用其他3種氮肥。葉綠素和蛋白質(zhì)的合成都離不開氮，氮素供應充足，能保證葉綠素和蛋白質(zhì)的合成，所以4種氮肥處理中李氏禾葉綠素、蛋白質(zhì)以及金屬硫蛋白含量均高于對照。在500 mg?kg-1銅處理土壤上生長的李氏禾金屬硫蛋白含量高于 100 mg?kg-1和 300 mg?kg-1處理組，可能是金屬硫蛋白的增加有助于植物解毒機制的加強。

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Abstract: Heavy metal pollution in soil has become the research hotspot. The performance of hyperaccumulator was affected by various soil properties. The primary objective of this work is to improve understanding of the impacts of Cu-accumulation in Leersia hexandra Swartz and to provide theoretical data for phytoremediation of Cu-polluted soils. This study analyzed the Cu-accumulation in L. hexandra, the plant growth and its physiological responses under different Cu pollution level (low: 100 mg?kg-1; Medium: 300 mg?kg-1; high: 500 mg?kg-1) for two months, applied (NH4)2SO4, CO(NH2)2, Ca(NO3)2and NH4NO3nitrogen fertilizer, respectively.According to the mass ratio of 0.3‰, soil nitrogen in the form of aqueous solution was added 1 time a week. The result indicated that when the Cu pollution level was 500 mg?kg-1, the highest mean levels of Cu-accumulation (roots: 6167.15 mg·kg-1; stem: 1251.99;leaf: 975.92 mg·kg-1) were detected in Ca(NO3)2treatment, which had significant difference from other nitrogen treatment group and control group (Cu-accumulation was 2.4～4.0 times as the control group). However, under each Cu pollution level (low, medium,high), NH4NO3treatment had the tallest plant height (68.5, 65.2 and 65 cm, respectively). CO(NH2)2treatment present higher data than other groups on the biomass (12.75, 13.45 and 11.63 g?10 plants-1, respectively), the chlorophyll content (24.139, 22.615 and 23.752 mg?L-1, respectively), soluble protein content (21.704, 23.506 and 20.940 mg?g-1, respectively) and the content of metallothionein (9131.06, 10014.02 and 11018.04 pg?g-1, respectively). The content of MDA reached the lowest in NH4NO3treatment which relieved effectively the damage on the plant cause by the copper. In summary, the biomass and Cu-accumulation of L.Hexandra can be effectively enhance by appropriate amount of nitrogen fertilizer application which improved its remediation effect in Cu-polluted soils.

Key words: Cu; Leersia hexandra Swartz; physiological response; nitrogen fertilizer morphology

Effect of Nitrogen Forms on Cu Uptake by the Leersia Hexandra Swartz and Physiological Response

ZHANG Cunkuan1,2, LIN Hua1,2*, MAN Xiangtian1,2, ZHANG Xuehong1,2, CHEN Jun1,2

1. Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China;2. Guangxi Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area，Guilin University of Technology, Guilin 541004, China

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.09.020

X173

A

1674-5906（2017）09-1599-06

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國家自然科學基金項目（41361085）

張存款（1990年生），男，碩士研究生，主要研究方向為水處理技術(shù)。E-mail: 1536696557@qq.com

*通信作者：林華（1984年生），男，博士研究生，主要研究方向為重金屬污染及恢復生態(tài)學。E-mail: linhua5894@163.com

2017-07-13