金屬離子與氨羧類螯合配體的鍵合特性研究

陳斌+王石慧+李蓉 樊安

摘要利用前沿色譜法，通過Cu2+、Ni2+和Co2+與螯合配體IDA 鍵合的準(zhǔn)確度（R2>0.98）與精密度（RSD <5%）實(shí)驗(yàn)，研究了前沿色譜法同時(shí)測定絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)KML與總鍵合位點(diǎn)數(shù)Λ0值的可行性。為了進(jìn)一步證明前沿色譜法的普適性，以Cu2+、Ni2+和Co2+為代表，在3種鍵合緩沖體系（NaAcHAc、NaPB、TrisHCl）中，考察了金屬離子在3種氨羧類螯合配體（IDA、Asp、Glu）上絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)KML的變化規(guī)律。結(jié)果表明，螯合配體對(duì)金屬離子鍵合強(qiáng)度遵循IDA>Asp>Glu；金屬離子對(duì)螯合配體鍵合強(qiáng)度遵循Cu2+>Ni2+>Co2+；3種鍵合緩沖體系中，NaAcHAc鍵合效果最好。按照M06/6311++G （d， p） 方法對(duì)螯合配體與金屬離子的結(jié)合能（ΔE）與吉布斯自由能（ΔG）進(jìn)行相關(guān)的量子計(jì)算。根據(jù)ΔE 與ΔG 的大小，從理論上推測出螯合配體與金屬離子的鍵合規(guī)律，此規(guī)律與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。本研究為金屬離子與螯合配體間鍵合參數(shù)的求取提供了有效的方法和手段，從而為今后提高IMAC柱的穩(wěn)定性，解決固定金屬親和柱在應(yīng)用過程中尤其是競爭洗脫過程中金屬離子的流失問題奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞前沿色譜法； 量子計(jì)算； 氨羧類螯合配體； 絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)； 總鍵合位點(diǎn)數(shù)

1引 言

自1975 年P(guān)orath 等[1]提出固定金屬離子親和色譜（Immobilized metal affinity chromatography，IMAC）的概念以來，該技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化中得到了廣泛應(yīng)用[2，3]。該方法利用螯合物中固定化的金屬離子與蛋白質(zhì)間的親和作用，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的分離和純化[4]。相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，IMAC 對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的選擇性。此外，與其它親和色譜相比，蛋白質(zhì)負(fù)載量高，更容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[5]。然而，金屬離子的泄漏是IMAC 柱在實(shí)際應(yīng)用過程中的致命缺陷[6，7]。該泄漏一方面與外部洗脫條件有關(guān)，另一方面與IMAC 柱自身即金屬離子與螯合配體的鍵合強(qiáng)度有關(guān)，后者起主導(dǎo)作用。鍵合強(qiáng)度越高，鍵合穩(wěn)定常數(shù)KML 越大，則IMAC 柱越穩(wěn)定，在蛋白質(zhì)競爭洗脫時(shí)金屬離子越不容易泄漏。因此，建立一種快速準(zhǔn)確測定鍵合強(qiáng)度的方法尤為重要。根據(jù)測得的鍵合參數(shù)可有效制備出高強(qiáng)度IMAC 柱，從而緩解甚至解決IMAC 柱上金屬離子的流失問題。

鍵合穩(wěn)定常數(shù)KML和總鍵合位點(diǎn)數(shù)Λ0直接體現(xiàn)金屬離子在螯合配體上的鍵合特性。KML和Λ0的傳統(tǒng)檢測方法存在諸多不足[8～13]。前沿色譜法（Frontal chromatography，F(xiàn)C）能夠在動(dòng)態(tài)條件下同時(shí)測定溶質(zhì)分子在配體上的KML和Λ0值，廣泛應(yīng)用于分子生物、藥物機(jī)理和藥物先導(dǎo)化合物的篩選研究[14～16]。在本課題組前期工作中，提出用FC法進(jìn)行IMAC柱上KML和Λ0值的測定，結(jié)合均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，制備出高穩(wěn)定性能的GluCu柱[17]。

IMAC 柱的穩(wěn)定性主要同金屬離子與螯合配體的鍵合強(qiáng)弱有關(guān)，而鍵合強(qiáng)弱又與金屬離子、絡(luò)合配基及鍵合溶液相關(guān)。因此，采用FC 法測定IMAC 柱上鍵合參數(shù)是否具有普適性，是本研究的工作重點(diǎn)。根據(jù)IMAC 固定金屬離子的選擇原則（金屬離子既要具有適宜的空軌道數(shù)目與螯合劑結(jié)合，還要有剩余的軌道親合待分離的蛋白質(zhì)），本研究以常見的過渡金屬離子Cu2+、Ni2+和Co2+為代表，分別考察了在NaAcHAc、NaPB、TrisHCl 的鍵合溶液體系下，金屬離子與IDA、Glu、Asp 的鍵合參數(shù)KML和Λ0。通過分析不同條件下鍵合參數(shù)的變化規(guī)律，以及與量子計(jì)算結(jié)果的比較，論證了方法的可行性。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

AKTA purifier10 生物色譜制備儀（Amersham Biosciences公司）；124PP 裝填機(jī)（日本Chemico公司）；純水儀（西安優(yōu)普儀器設(shè)備公司）。 硅膠（粒徑7 μm，孔徑30 nm，蘭州物理化學(xué)研究所）；γ縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（γGLDP，分析純，遼寧蓋縣化工研究所）；亞氨基二乙酸（IDA，分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.25 MΩ·cm）。

2.2固定相的制備

按照文獻(xiàn)[6]分別制得IDA硅膠填料、Asp硅膠填料和Glu硅膠填料。采用勻漿法，將上述不同螯合配體硅膠填料分別裝填至規(guī)格為50 mm × 4.6 mm的不銹鋼柱內(nèi)，在40 MPa 的壓力下裝填12 min， 依次得到IDA硅膠柱、Asp硅膠柱和Glu硅膠柱。

2.3KML和Λ0的測定

2.3.1空白突破曲線的測定用5.00 mmol/L NaNO225 mmol/L NaAcHAc 緩沖溶液（pH 4.0）以0.5 mL/min 的流速依次通過未鍵合金屬離子的不同螯合配體硅膠柱，直至在356 nm 處的紫外可見吸收值達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，即得到空白突破曲線。

2.3.2金屬離子突破曲線的測定用0.30 mmol/L CuSO425 mmol/L NaAcHAc 緩沖溶液（pH 4.0）以0.5 mL/min 的流速通過IDA硅膠柱，直至在700 nm 處的紫外可見吸收值達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，即得到一條金屬離子突破曲線，該突破曲線為金屬離子在螯合柱上達(dá)到飽和吸附量時(shí)所對(duì)應(yīng)的平臺(tái)曲線。依次用0.50， 0.60， 0.80 和1.00 mmol/L 等一系列濃度的CuSO425 mmol/L NaAcHAc（pH=4.0） 重復(fù)上述步驟，得到一系列不同濃度Cu2+在IDA硅膠柱上的突破曲線。每測完一條突破曲線，用0.05 mmol/L EDTANa2溶液將鍵合在色譜柱上的金屬Cu2+洗脫。

不同濃度金屬Cu2+的其它鍵合緩沖溶液（NaPB、TrisHCl）分別在Asp硅膠和Glu硅膠柱，以及不同濃度金屬Ni2+，Co2+的3種鍵合緩沖溶液（NaAcHAc、NaPB、TrisHCl）分別在IDA硅膠柱，Asp硅膠柱和Glu硅膠柱上的突破曲線均按上述步驟獲得。endprint

2.3.3表觀摩爾吸附量的計(jì)算用Peakfit（V4.12） 軟件分別對(duì)空白突破曲線和金屬離子突破曲線進(jìn)行一階微分處理，得到曲線拐點(diǎn)處所對(duì)應(yīng)的時(shí)間，即為空白突破時(shí)間to和金屬離子突破時(shí)間tm。由式（1）計(jì)算達(dá)到突破時(shí)間時(shí)的表觀摩爾吸附量[18]。

Qe=V×（tm-t0）×[M]60×1000（1）

其中，Qe 為達(dá)到平衡時(shí)的表觀摩爾吸附量（mol）；v 為流速（0.5 mL/min）；tm 為不同濃度金屬離子的突破時(shí)間（min）；to 為NaNO2 的空白突破時(shí)間（min）；[M] 為金屬離子的濃度（mol/L）。

2.3.4KML值與Λ0值的求取金屬離子在螯合色譜柱上的吸附符合單位點(diǎn)的Langmuir 吸附等溫模型[19]：

Qe=KMLΛ0[M]1+KML[M]（2）

將（2）式取倒數(shù)可得：

1Qe=1KMLΛ0[M]+1Λ0（3）

其中，KML為金屬離子在絡(luò)合配基上的絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)（L/mol）； Λ0為金屬離子在絡(luò)合配基上的總鍵合位點(diǎn)數(shù)（mol）。由公式（3）可知1/Qe和1/[M] 呈線性關(guān)系，根據(jù)斜率和截距可求出KML和Λ0。

3結(jié)果與討論

3.1KML和Λ0的測定

以金屬Cu2+為例，在25 mmol/L NaAcHAc鍵合緩沖溶液（pH=4.0）體系下，按照2.3.2節(jié)的方法測得不同濃度Cu2+在IDA 螯合配體上的前沿突破曲線，得到圖1的結(jié)果。

根據(jù)2.3.3節(jié)的方法得到不同濃度Cu2+的tm和Qe。由圖1和表1可知，隨著Cu2+濃度的升高，tm 減小，Qe 增大。表明當(dāng)Cu2+濃度升高時(shí)，有利于Cu2+在IDA硅膠柱上的吸附，短時(shí)間內(nèi)金屬Cu2+在IDA硅膠柱上迅速達(dá)到吸附平衡，且吸附量逐漸增大。

根據(jù)公式（3）將1/Qe 和1/[M] 進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖2所示。 Cu2+濃度在0.30～1.00 mmol/L 的范圍內(nèi)，1/Qe與1/[M] 呈良好的線性相關(guān)性，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.985。這充分說明了在NaAcHAc 的鍵合緩沖體系中，金屬Cu2+在IDA螯合配體上的吸附特性符合單位點(diǎn)的Langmuir 吸附等溫模型。根據(jù)1/Qe與1/[M] 的線性方程可以得到在25 mmol/L NaAcHAc鍵合緩沖體系（pH=4.0）的條件下，金屬Cu2+在IDA 螯合柱上的絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)KML=1.12×104 L/mol， 鍵合位點(diǎn)數(shù) Λ0=9.31×10

Symbolm@@ 6。

3.2FC方法的準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn)

為了考察本法的準(zhǔn)確性與可靠性，在25 mmol/L NaAcHAc（pH=4.0）鍵合緩沖溶液的體系下，對(duì)不同的金屬離子，在IDA螯合柱上進(jìn)行吸附特性的研究，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，3種金屬離子（Cu2+、Ni2+和Co2+）濃度在0.30～1.00 mmol/L范圍內(nèi)，1/Qe和1/[M] 的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.98；吸附特性參數(shù)KML和Λ0的RSD分別低于2.7% 和3.9%。說明方法的準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。這是因?yàn)镮DA是一種含有3個(gè)配位原子的氨羧類絡(luò)合劑，可以與Cu2+、 Ni2+和Co2+以1∶1的絡(luò)合比進(jìn)行絡(luò)合，金屬離子在其上的吸附符合單位點(diǎn)的Langmuir 吸附等溫模型。此外，Cu2+、Ni2+和Co2+與IDA 的絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)遵循如下順序KML（CuIDA） > KML（NiIDA） >KML（CoIDA），此結(jié)果與理論推測相一致[20～22]。

由此可見，利用FC 法可準(zhǔn)確有效地求得表征金屬離子在氨羧類螯合劑上鍵和特性的參數(shù)KML和Λ0， 并且通過評(píng)價(jià)參數(shù)KML直觀地反映出不同的金屬離子與螯合劑結(jié)合能力的強(qiáng)弱，這也為分析金屬離子與螯合劑的鍵合強(qiáng)度以及間接地判斷IMAC 柱的穩(wěn)定性提供了依據(jù)。

3.3金屬離子在氨羧類螯合配體上的鍵合特性

為了進(jìn)一步論證FC 法的通用性， 將研究范圍擴(kuò)大到Glu，Asp螯合配體以及NaPB 和TrisHCl 鍵合緩沖體系中，依次考察了Cu2+、 Ni2+和Co2+的鍵合特性，結(jié)果如表3所示。

從表3可知，在相同的鍵合緩沖體系下：（1）3種金屬離子對(duì)不同螯合配體柱的絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)遵循：KML（CuIDA） > KML（CuAsp） >KML（CuGlu）；KML（NiIDA）>KML（NiAsp）>KML（NiGlu）；KML（CoIDA） >KML（CoAsp） >KML（CoGlu），均表現(xiàn)為螯合配體對(duì)金屬離子鍵合強(qiáng)度：IDA>Asp>Glu。這一規(guī)律與本課題組先前用AAS法測得的結(jié)果相符[23，24]；（2）3種金屬離子對(duì)相同螯合配體柱的絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)遵循：KML（CuIDA） > KML（NiIDA） >KML（CoIDA）；KML（CuAsp） > KML（NiAsp） >KML（CoAsp）；KML（CuGlu） > KML（NiGlu） >KML（CoGlu），均表現(xiàn)為金屬離子對(duì)螯合配體鍵合強(qiáng)度：Cu2+>Ni2+>Co2+。這是因?yàn)镃u2+、Ni2+和Co2+的半徑分別為69、72和74 pm，當(dāng)金屬離子的電荷數(shù)相等時(shí)，隨著金屬離子半徑的依次增大高，金屬離子與絡(luò)合劑間的配位作用會(huì)逐步減弱[25]。 此外，3種鍵合緩沖體系中，NaAcHAc 的鍵合效果最好，這與文獻(xiàn)[25]的研究結(jié)論一致。

為了進(jìn)一步論證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，用Gaussian 09 軟件對(duì)上述金屬離子與螯合配體進(jìn)行量子模擬計(jì)算：采用B3LYP 和631G（d） 基組進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化，在M06/6311++G（d， p）水平計(jì)算螯合配體與金屬離子的結(jié)合能（ΔE）與吉普斯自由能（ΔG），結(jié)果見表4。ΔE 在一定程度上體現(xiàn)了金屬離子與螯合配體構(gòu)型的穩(wěn)定性：ΔE 越高， 說明這種構(gòu)型在配位過程中越容易產(chǎn)生且能穩(wěn)定存在；ΔG 反映了反應(yīng)正向進(jìn)行的趨勢， 其為負(fù)值說明反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行，且數(shù)值的絕對(duì)值越大，螯合物構(gòu)型越穩(wěn)定，說明金屬離子與螯合配體的鍵合力越大。endprint

由表4 可知，ΔE>0， ΔG<0 ， 說明這9種螯合物都能穩(wěn)定存在。對(duì)于同一種螯合配體而言，金屬離子與其的鍵合能力均表現(xiàn)為Cu2+>Ni2+>Co2+。這是因?yàn)楫?dāng)金屬離子所帶電荷相同時(shí)，螯合物的穩(wěn)定性與金屬離子的半徑有關(guān)[24～26]：金屬離子的半徑越小，螯合物的ΔE 和ΔG （絕對(duì)值）越大，則結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。因此量子計(jì)算的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

金屬離子與螯合配體是按照1∶1 的絡(luò)合比形成穩(wěn)定的螯合物[27]，因此不同配體的空間構(gòu)型將對(duì)金屬離子與其螯合的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。由螯合配體的結(jié)構(gòu)可知，對(duì)于提供同樣配位原子的螯合體，

主鏈上含有配位原子的螯合體能夠與金屬離子形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；此外，螯合配體的鏈長也會(huì)影響其與金屬離子的鍵合能力。計(jì)算結(jié)果表明，對(duì)于同一種金屬Cu2+而言，IDA與其的鍵合能力最強(qiáng)；與Asp 與Glu相比，由于IDA 主鏈上含有提供配位的N原子，使得金屬Cu2+與其配位后形成的絡(luò)合物更加穩(wěn)定[27]。而Asp與Glu 結(jié)構(gòu)相似，主鏈上含有更多的CH2， 使得這兩種螯合配體與金屬離子相結(jié)合時(shí)，空間位阻較大，導(dǎo)致形成的螯合物的穩(wěn)定性較弱[28，29]。而對(duì)于Ni2+和Co2+而言，計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差，這可能是因?yàn)槔碚摰挠?jì)算是在水溶液進(jìn)行的，忽略了鍵合緩沖溶液的影響。

4結(jié) 論

本研究在FC 法的基礎(chǔ)上，利用Langmuir 單位點(diǎn)的等溫吸附模型，考察了在不同緩沖體系條件下，不同金屬離子與不同螯合配體間的鍵合穩(wěn)定參數(shù)之間的關(guān)系。通過數(shù)據(jù)分析與比較，論證了FC 法在IMAC 制備過程中金屬離子對(duì)螯合配體鍵合參數(shù)測定的普適性。本研究為金屬離子與螯合配體間鍵合參數(shù)方便快速的求取提供了有效的方法和手段，從而為今后制備高強(qiáng)度IMAC 柱，解決IMAC 柱在使用過程中金屬離子的流失問題奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Study on Binding Characteristics of Aminocarboxyl

Chelating Ligands for Metal Ions

CHEN Bin， WANG ShiHui， LI Rong*， FAN An

（School of Chemical Engineering， Northwest University， Xi'an 710069， China）

AbstractThe feasibility of frontal chromatography for determining the complexation stability constant KML and total mole of binding site Λo was demonstrated by the accuracy and precision binding experiments between metal ions （Cu2+， Ni2+ and Co2+） and chelating ligand （IDA）， in which R2>0.98 and RSD <5%. To further prove the universality of the frontal chromatography， the changing rules of KML values between Cu2+， Ni2+， Co2+ and IDA， Asp， LGlu were examined under NaAcHAc， NaPB and TrisHCl buffer systems. The results showed that the binding strength of chelating ligands for metal ions followed IDA>Asp>Glu； binding strength of metal ions for chelate ligands followed Cu2+>Ni2+>Co2+； and the binding effect with NaAcHAc buffer was the best. In aqueous solution， quantum computing of binding energy （ΔE） and gibbs free energy （ΔG） between chelating ligand and metal ion was performed at the M06/6311++G （d， p） level. According to ΔE and ΔG， the binding rules between chelating ligand and metal ion were predicted theoretically. These rules were basically in agreement with above experimental results. The present work provided effective method for studying on binding characteristics of metal ions for aminocarboxyl chelating ligands， thus exhibited a good foundation for improving the stability of immobilized metal affinity chromatographic column and solving the leakage of metal ions from the column in the process of competitive elution.

KeywordsFrontal chromatography； Quantum computing； Aminocarboxyl chelating ligand；Complexation stability constant； Total mole of binding site

（Received 15 March 2017； accepted 22 June 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21376191） and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province， China （No. 2011JM2013）， the Service Local Special Project of Shaanxi Province Education Department （No.14JF027） and the Industrialization Cultivation Item of Shaanxi Province Educational Department （No.2013jc23）endprint