徐 群， 劉 巖， 宮慶禮

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

鼠尾藻hsp70基因的克隆及溫度、鹽度對其表達(dá)的影響*

徐 群， 劉 巖**， 宮慶禮

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

為研究溫度、鹽度及其處理時間對鼠尾藻(Sargassumthunbergii)hsp70表達(dá)水平的影響，以β-actin為內(nèi)參基因，通過RT-qPCR測定不同處理下鼠尾藻幼苗的hsp70表達(dá)水平。溫度實(shí)驗(yàn)設(shè)置7個處理組(5、10、15、25、30、35和40℃)、鹽度實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個處理組(0、10、20、40和50)，以溫度20℃、鹽度31為對照組；溫度處理時間實(shí)驗(yàn)在溫度35℃下熱激不同時間(0、1、2、3、4、6、8、10和12 h)，鹽度處理時間實(shí)驗(yàn)在鹽度50下處理不同時間(0、1、2、3、4、6、8、10和12 h)。研究顯示：(1)在不同溫度下處理鼠尾藻幼苗1 h，40℃組的hsp70表達(dá)水平最高，是對照組(20℃)的8.6倍，恢復(fù)處理1 h后，5℃組與對照組差異不顯著，35、40℃組與對照組仍差異顯著；(2)鼠尾藻幼苗在(0、10、20、31、40、50)鹽度下處理2 h，發(fā)現(xiàn)0、10、40、50鹽度組的hsp70表達(dá)水平顯著高于對照組，恢復(fù)處理2 h后，0鹽度組鼠尾藻幼苗的hsp70表達(dá)水平最高；(3)將鼠尾藻幼苗在35℃下熱激不同時間，樣品的hsp70表達(dá)水平先上升后下降，熱激4 h時表達(dá)量最大，不同熱激時間處理組在20℃中恢復(fù)1 h后，處理1、2和3 h的實(shí)驗(yàn)組在恢復(fù)后hsp70表達(dá)水平高于相應(yīng)的處理組；(4)將鼠尾藻幼苗在鹽度50中培養(yǎng)不同時間，樣品的hsp70表達(dá)水平先升高后下降，在6 h時達(dá)到最高，不同鹽度時間處理組在鹽度31下恢復(fù)2 h后，其hsp70表達(dá)水平變化情況與35℃熱激不同時間各處理組的變化趨勢相同。研究結(jié)果表明，在本研究中，鼠尾藻hsp70表達(dá)水平在溫度40℃、鹽度50、高溫?zé)峒? h和高鹽處理6 h情況下分別達(dá)到最大值，調(diào)控效果顯著，說明HSP70可能參與了各脅迫下的生物代謝和抗逆反應(yīng)。

鼠尾藻；hsp70基因；溫度；鹽度；脅迫；熒光定量PCR

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)屬于褐藻門(Phaeophyta)馬尾藻科(Sargassaceae)馬尾藻屬(Sargassum)，是一種分布在我國北起遼東半島的南至雷州半島潮間帶的廣溫廣鹽物種，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值[1]。鼠尾藻營養(yǎng)價值較高，是鮑魚、海參等海洋珍品的天然餌料，且其具有較強(qiáng)的吸收營養(yǎng)鹽和富集重金屬的能力，是潮間帶海藻床的重要組成部分，在修復(fù)和保護(hù)海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[2-4]。

HSP70家族是熱休克蛋白(HSPs)中研究最廣泛的和最重要的一個家族，具有高度的保守性，在正常情況下與應(yīng)激條件下都發(fā)揮重要的生理功能，包括組成型的HSC70和誘導(dǎo)型的HSP70[5]。在正常情況下，HSC70在生物體中起著控制跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)新生蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器，折疊新翻譯的蛋白等重要作用。在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激原的刺激下，HSP70高度誘導(dǎo)表達(dá)，參與變性蛋白的重新折疊，修復(fù)錯誤折疊的蛋白，并幫助受損的蛋白質(zhì)降解，具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，提高生物對環(huán)境脅迫的耐受性，保護(hù)生物免受損傷的作用。

晝夜、季節(jié)、氣候變化等原因會導(dǎo)致潮間帶的溫度、鹽度、光照等環(huán)境因子劇烈變化。作為潮間帶的典型物種，鼠尾藻在長期的進(jìn)化過程中，其必然發(fā)展了應(yīng)對環(huán)境脅迫的機(jī)制。近年來，HSP70在大藻[6-11]應(yīng)激中的研究已陸續(xù)開展，但褐藻中僅有齒緣墨角藻(Fucusserratus)[12]、海帶(Saccharinajaponica)和裙帶菜(Undariapinnatifida)[13]的hsp70基因的應(yīng)激反應(yīng)報道。目前，關(guān)于鼠尾藻的研究多集中在抵御環(huán)境脅迫的生理生態(tài)學(xué)方面[14-15]，關(guān)于鼠尾藻hsp70基因的研究尚未見報道。本文采用RT-qPCR技術(shù)研究了2種重要環(huán)境因子溫度、鹽度及其處理時間對鼠尾藻hsp70表達(dá)水平的影響，旨在為海藻抗逆生理機(jī)制研究和培育抗逆經(jīng)濟(jì)藻類新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與暫養(yǎng)

2015年9月下旬在青島太平角潮間帶礁石采集鼠尾藻幼苗，去除雜藻及附生生物，用滅菌海水反復(fù)沖洗干凈，切取尖端1 cm長短的藻段，在20℃，90 μE·m-1·s-1，12 h∶12 h光周期下，過濾滅菌海水充氣暫養(yǎng)3 d。

1.2 脅迫處理

鼠尾藻幼苗在30 ℃下熱激1 h，迅速吸干水分，放入液氮中冷凍，-80 ℃保存，用于提取RNA，克隆hsp70、β-actin基因片段。

溫度實(shí)驗(yàn)設(shè)置7個溫度組(5、10、15、25、30、35和40 ℃)與對照組(20 ℃)，每個組3個平行。培養(yǎng)條件為90 μE·m-1·s-1，光周期為12 h∶12 h，鹽度為31，1/8 PESI培養(yǎng)基。分別測定培養(yǎng)1 h后和在對照條件下恢復(fù)1 h后鼠尾藻幼苗的hsp70的表達(dá)量。

鹽度實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個鹽度組(0、10、20、40和50)與對照組(鹽度31)，每個組3個平行。培養(yǎng)條件為90 μE·m-1·s-1，光周期為12 h∶12 h，溫度為20℃，1/8 PESI培養(yǎng)基。分別測定培養(yǎng)2 h后和在對照條件下恢復(fù)2 h后鼠尾藻幼苗的hsp70表達(dá)量。

溫度處理時間實(shí)驗(yàn)，35℃熱激不同時間(0、1、2、3、4、6、8、10和12 h)，每個時間點(diǎn)設(shè)置3個平行。培養(yǎng)條件為90 μE·m-1·s-1，光周期為12 h∶12 h，鹽度為31，1/8 PESI培養(yǎng)基。分別測定熱激后和恢復(fù)培養(yǎng)1 h后鼠尾藻幼苗的hsp70表達(dá)量。

鹽度處理時間實(shí)驗(yàn)，鹽度50處理不同時間(0、1、2、3、4、6、8、10和12 h)，每個時間點(diǎn)設(shè)置3個平行。培養(yǎng)條件為90 μE·m-1·s-1，光周期為12 h∶12 h，溫度為20℃，1/8 PESI培養(yǎng)基。分別測定鹽度脅迫后和恢復(fù)培養(yǎng)2h后鼠尾藻幼苗的hsp70表達(dá)量。

1.3 鼠尾藻RNA的提取

液氮研磨鼠尾藻樣品，按照OMEGA R6827-01試劑盒說明書提取RNA，用NanoDrop測定提取的RNA的濃度和純度(0D260/OD280)，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)RNA完整性后，按照TaKaRa 047A試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 引物的設(shè)計與hsp70、β-actin基因片段的克隆

參考Fu等[16]一文中設(shè)計的hsp70的一對簡并引物HSP70F/R(見表1)，根據(jù)已知物種的β-actin序列(AB053215.1、AB097503.1 、FJ375360、 AY305726、KC469585、JX310002)，利用CodeHop原理[17]設(shè)計β-actin的一對簡并引物β-actinF/R(見表1)，進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增hsp70cDNA片段和β-actincDNA片段。PCR反應(yīng)體系10 μL，包含1 μL cDNA模板，1μL 10×PCR buffer，0.8μLdNTP，5.15 μL dH2O，0.05 μL的TaKaRa Ex Taq和1 μL×2引物(10 mmol/L)。94℃預(yù)變性3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列

1.5 hsp70基因的表達(dá)分析

獲得的基因序列為模板，利用Primer5.0軟件設(shè)計特異引物HSP70HF/HR和β-actinHF/HR，擴(kuò)增片段長度分別為138和182 bp(見表1)，對不同溫度、鹽度、溫度時間、鹽度時間處理的鼠尾藻幼苗的hsp70基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為20μL，包括：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL；PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL；cDNA 模板2.0 μL；DEPC水7.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。將熒光定量PCR檢測結(jié)果導(dǎo)出，采用2-ΔΔCt法，用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 鼠尾藻RNA提取

1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA的質(zhì)量(見圖1)。從圖中可以看到2條清晰的條帶28S和18S，還能看到模糊的5S條帶，28S RNA條帶的亮度是18S RNA條帶亮度的2倍，說明提取的總RNA沒有降解。用NanoDrop測得的總RNA的OD260/OD280范圍在1.8～2.0之間，說明提取的RNA質(zhì)量較好，符合RT-qPCR的要求。

圖1 鼠尾藻總RNA提取電泳圖Fig.1 Total RNA of Sargassum thunbergii

2.2 hsp70 cDNA和β-actin cDNA序列

將鼠尾藻總RNA進(jìn)行RT-PCR，利用引物HSP70F/R和β-actinF/R進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到620 bp左右的條帶(見圖2a)和530 bp左右的條帶(見圖2b)。經(jīng)克隆后測序，得到633 bp的hsp70片段和522 bp的β-actin片段。測序結(jié)果經(jīng)過BLAST分析，表明克隆得到的序列和已報道的齒緣墨角藻(Fucusserratus)hsp70基因(EU780017.1)相似性很高，表明克隆得到的片段為鼠尾藻hsp70基因片段。

( (a)hsp70基因cDNA片段； (a)hsp70 gene cDNA sequence ofSargassumthunbergii；(b)β-actin基因cDNA片段；(b) β-actin gene cDNA sequence ofSargassumthunbergii。M：Maker DNA分子量。M：Marker DNA ladder.)

圖2 鼠尾藻hsp70基因、β-actin基因cDNA擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 The amplification result of Sargassum thunbergii heat shock protein 70 gene and β-actin gene cDNA sequence

2.3 鼠尾藻hsp70基因的表達(dá)分析

不同溫度處理鼠尾藻幼苗1 h后，hsp70表達(dá)量隨著溫度升高出現(xiàn)先降低后升高的趨勢(見圖3)。10～30 ℃處理組中，hsp70表達(dá)水平相對較低，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。5、35和40℃組，hsp70表達(dá)量分別是對照組的4.4、3.9和8.6倍，差異極顯著(P<0.01)。恢復(fù)處理1 h后，35和40 ℃組hsp70表達(dá)量與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，而5 ℃組的可基本恢復(fù)正常(P>0.05)。

不同鹽度處理鼠尾藻幼苗2 h后，hsp70表達(dá)量隨鹽度升高出現(xiàn)先降低后升高的趨勢(見圖4)。除了20鹽度組，其他處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)?；謴?fù)處理2 h后，0、10和50恢復(fù)組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。0和10恢復(fù)組與處理組相比，hsp70表達(dá)量有所升高，這可能與HSP70參與損傷后修復(fù)相關(guān)。40和50恢復(fù)組與處理組相比hsp70表達(dá)量有所降低。

圖5顯示了35 ℃不同熱激時間處理和恢復(fù)后，鼠尾藻hsp70表達(dá)量的變化。35 ℃熱激1 h后，鼠尾藻hsp70表達(dá)量是對照組的4.8倍，差異極顯著(P<0.01)。之后hsp70表達(dá)量逐漸升高，4 h后達(dá)到最高，之后隨著時間的推移表達(dá)量逐漸降低，10 h后與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。恢復(fù)處理組與對照組相比hsp70表達(dá)量增加，1、2、3、4、6和8 h差異顯著，10和12 h差異不顯著。1、2和3 h恢復(fù)組hsp70表達(dá)量高于處理組。

(*表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異顯著(P<0.05)；**表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。*Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.05 level； ** Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.01 level.)

圖3 在不同熱激溫度下鼠尾藻hsp70表達(dá)水平定量PCR分析
Fig.3 Under different heat shock temperatures,Sargassumthunbergiihsp70 expression levels analyzed by real-time quantitative RT-PCR

(*表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異顯著(P<0.05)； **表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。*Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.05 level； ** Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.01 level.)

圖4 在不同鹽度脅迫下鼠尾藻hsp70表達(dá)水平定量PCR分析
Fig.4 Under different salt concentration stresses,Sargassumthunbergiihsp70 expression levels analyzed by real-time quantitative RT-PCR

圖6為50鹽度下處理不同時間和恢復(fù)2 h后，鼠尾藻hsp70表達(dá)量的變化。50鹽度脅迫1 h后，鼠尾藻hsp70表達(dá)量是對照組的3.2倍，之后隨著時間的推移表達(dá)量先升高后降低，6 h時達(dá)到最大值。其中2、3、4、6和8 h與0 h對照組相比差異顯著。處理6 h，恢復(fù)2 h后，鼠尾藻hsp70表達(dá)量與對照組相比增加。

3 討論

熱休克蛋白是一類從細(xì)菌、植物到動物中廣泛存在的熱激類蛋白質(zhì)。其中HSP70在生物體受到逆境脅迫時作為分子伴侶可以保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)，提高機(jī)體的耐受性，減輕逆境脅迫對機(jī)體的傷害[20]。目前，已有大量研究表明，在重金屬、鹽度、溫度等脅迫條件下潮間帶無脊椎動物[21-24]和陸生植物[25-28]生物體中hsp70快速表達(dá)，但對脅迫下大型海藻的熱休克反應(yīng)研究還比較少，其中褐藻中僅克隆出了齒緣墨角藻、海帶和裙帶菜hsp70基因全長并分析了其在逆境脅迫條件下hsp70的表達(dá)水平。本研究克隆了潮間帶非移動生物鼠尾藻hsp70基因片段，研究了其在溫、鹽脅迫條件處理下表達(dá)水平的變化情況，為研究鼠尾藻抗逆分子機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

(*表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異顯著(P<0.05)；**表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。*Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.05 level； **Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.01 level.)

圖5 在不同溫度處理時間下鼠尾藻hsp70表達(dá)水平定量PCR分析

Fig.5 Under different heat shock times,Sargassumthunbergiihsp70 expression levels analyzed by real-time quantitative RT-PCR

(*表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異顯著(P<0.05)；**表示該處理下hsp70表達(dá)量與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。*Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.05 level； **Means significant difference between the treatment groups and control group at 0.01 level.)

圖6 在不同鹽度時間脅迫下鼠尾藻hsp70表達(dá)水平定量PCR分析

Fig.6 Under different salt concentration times,Sargassumthunbergiihsp70 expression levels analyzed by real-time quantitative RT-PCR

在大型海藻中，短時間的熱激脅迫誘導(dǎo)HSPs的表達(dá)，其表達(dá)量隨著溫度的升高達(dá)到峰值后逐漸下降[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溫度處理鼠尾藻1h后，低溫和高溫組鼠尾藻hsp70表達(dá)量顯著高于對照組，表明鼠尾藻hsp70的表達(dá)量受溫度脅迫調(diào)節(jié)。恢復(fù)培養(yǎng)1h后，低溫處理組hsp70表達(dá)量下降，與對照組相比差異不顯著，高溫處理組hsp70表達(dá)量有所下降且與對照組相比差異極顯著，說明高溫脅迫處理后的鼠尾藻HSP70可以持續(xù)的作用，參與高溫?fù)p傷后修復(fù)。高溫處理鼠尾藻幼苗1 h后，hsp70表達(dá)量隨著溫度的升高逐漸升高，與同為褐藻屬的海帶在高溫下的表達(dá)模式不同，海帶孢子體在35或40 ℃下處理1 h后hsp70表達(dá)水平顯著低于25或30 ℃處理1 h后的表達(dá)水平；但與同為潮間帶海藻的綠藻孔石莼(Ulvapertusa)高溫下的表達(dá)模式相同，35或40 ℃下處理1 h后hsp70表達(dá)水平顯著高于25或30 ℃處理1h后的表達(dá)水平[13]。出現(xiàn)這種差異的原因可能是鼠尾藻和孔石莼同屬潮間帶海藻，在適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境過程中產(chǎn)生了相同的應(yīng)對高溫脅迫機(jī)制，相比于潮下帶的海帶可以耐受更高的溫度。在恢復(fù)處理后，高溫組hsp70的表達(dá)量仍很高，表明HSP70可以持續(xù)作用以修復(fù)高溫造成的損傷。此外，在熱激時間脅迫處理中，hsp70的表達(dá)量先升高后下降，可能是因?yàn)殚L時間的高溫脅迫造成HSP70及其他酶類失活或相關(guān)的mRNA的合成等受到抑制等原因[29]。

由于水分蒸發(fā)、降雨、徑流等原因，生長在潮間帶的鼠尾藻會遭受到鹽度脅迫。在高等植物中的研究表明，鹽度脅迫可以由核心轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游分子伴侶hsp基因的表達(dá)[30]。本研究表明鼠尾藻hsp70的表達(dá)受鹽度以及鹽度脅迫時間的影響，HSP70有可能在抗逆機(jī)制中扮演重要角色。在自然條件下，鼠尾藻更容易遇到低鹽的環(huán)境，藻體的細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜會遭受低滲透的脅迫，藻體迅速提高HSP70蛋白的量以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，減輕細(xì)胞損傷，幫助藻體度過不良環(huán)境。

4 結(jié)語

本研究克隆了鼠尾藻hsp70基因的片段序列，并首次分析了鼠尾藻在溫度、鹽度脅迫下hsp70基因的表達(dá)變化。研究表明hsp70基因的表達(dá)受溫度、鹽度影響顯著，HSP70有可能參與了脅迫下的生物代謝和抗逆反應(yīng)。hsp70基因片段的克隆及表達(dá)分析為鼠尾藻優(yōu)良種質(zhì)資源的開發(fā)和利用提供了基礎(chǔ)資料。

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Abstract: A cDNA fragment encoding the HSP70 ofSargassumthunbergiiwas isolated using RT-PCR technique. Withβ-actinas the internal control, relative abundance ofhsp70transcripts ofS.thunbergiiat different temperatures and salinities was determinedwithRT-qPCR.S.thunbergiiwas cultured at different temperatures for 1h or different salinities for 2h. It was also kept at 35℃ or at 50psu salinity for different durations. The results showed that (1) at different temperatures (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40℃)for 1h, the abundance ofhsp70transcripts at 40℃ was the highest, 8. 6folds higher than that at 20℃. After an 1hrecovery, the difference between 5℃and control was not significant while that between 35℃and 40℃was significant; (2) at different salinities (0, 10, 20, 31, 40 and 50) for 2h, the abundance ofhsp70transcripts at 0, 10, 40 and 50psu was significantly higher than that at 30psu while that after recoveryat 0psu for 2h was the highest; (3) at 35℃ for different durations (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 and 12), the expression ofhsp70showed a trend of rising first and falling then, reaching the top at 4h, and for less than 3h, the expression increased after an 1hrecovery; and (4) at 50psu for different durations (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 and 12h), the abundance ofhsp70transcripts showed a trend of rising first and falling then, reaching the highest after 6h while after recovery at 30psu for 2h, the expression ofhsp70showed the same trend as that at 35℃. The results showed that the expression ofhsp70 was influenced by high temperatures and salinities. Such response may participate in the physiology processes of stress resistance.

Key words:Sargassumthunbergii;hsp70; temperature; salinity; stress; RT-qPCR

責(zé)任編輯 朱寶象

Isolation ofSargassumthunbergiihsp70 Gene and Its Expression Analysis at Different Temperatures and Salinities

XU Qun, LIU Yan, GONG Qing-Li

(The Key Laboratory of Mariculture(Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China)

S968.42

A

1672-5174(2017)11-024-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20160148

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海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201405040-4)資助 Supported by Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean(201405040-4)

2016-04-27；

2016-12-06

徐 群(1990-)，女，碩士生，研究方向?yàn)樵孱惿韺W(xué)。E-mail：xuqun09111628@163.com

** 通訊作者：E-mail：qd-liuyan@ouc.edu.cn