何瑞鵬， 奉 杰， 田相利, 董雙林， 李海東

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003)

酪酸菌對珍珠龍膽石斑魚生長、消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響*

何瑞鵬， 奉 杰， 田相利**, 董雙林， 李海東

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003)

酪酸菌(Clostridiumbutyricum)是近年來新開發(fā)的益生菌菌種，具有多種重要的生理功能，但目前在水產(chǎn)動物中的研究相對較少。本文初步研究了飼料中添加不同濃度的酪酸菌CBYG01對珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂)生長、消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響。以基礎飼料為對照組，在基礎飼料中分別添加濃度為1×107cfu/kg(CB1組)、1×109cfu/kg(CB2組)、1×1011cfu/kg(CB3組)的酪酸菌活菌菌體以及1×109cfu/kg(CBM組)的酪酸菌發(fā)酵液。石斑魚初始體重為(42.91±1.47) g，養(yǎng)殖60天后，分別測定其生長、消化酶活性以及血清超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、溶菌酶(LSZ)活性等指標。研究表明，CB3組石斑魚末體重、特定生長率、攝食量和食物轉化效率均顯著高于對照組(P<0.05)，胃蛋白酶、腸道胰蛋白酶、脂肪酶和前腸淀粉酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，胃蛋白酶、前腸脂肪酶和前腸淀粉酶活性顯著高于CB1和CB2組(P<0.05)，而與CBM組無顯著差異(P>0.05)。CB3組石斑魚血清SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，GPx、CAT和LSZ活性顯著高于CB1、CB2組和對照組(P<0.05)，SOD、CAT和LSZ活性與CBM組無顯著差異(P>0.05)；CBM組石斑魚血清SOD、CAT、GPx和LSZ活性均顯著高于對照組(P<0.05)；CB2組GPx和LSZ活性顯著高于對照組(P<0.05)。研究結果表明，飼料中補充添加不同濃度的酪酸菌活菌菌體和發(fā)酵液對珍珠龍膽石斑魚的生長、消化酶活性和非特異性免疫酶活性具有不同的促進效果，其中以添加1×1011cfu/kg的活菌菌體效果最佳。

珍珠龍膽石斑魚；酪酸菌；生長；消化酶；抗氧化酶；溶菌酶

珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂)又稱龍虎斑或珍珠斑，是用棕點石斑魚(E.fuscoguttatus♀)和鞍帶石斑魚(E.lanceolatus♂)培育出來的雜交新品種石斑魚[1-2]，具有適應能力強、抗病力強、生長速度快、肉質(zhì)細膩等優(yōu)點[2-3]，已成為我國南方沿海、香港以及馬來西亞等東南亞國家重要的石斑魚養(yǎng)殖品種[4-5]。同時，由于性格溫馴和耐受能力強等特點，珍珠龍膽石斑魚適合池塘、網(wǎng)箱和工廠化等多種養(yǎng)殖模式，特別適合高密度養(yǎng)殖[6]。但是，隨著工廠化等高密度養(yǎng)殖模式的迅速發(fā)展，導致了細菌、病毒等傳染病的頻繁發(fā)生，繼而給育苗和養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[7-9]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖傳統(tǒng)的預防和治療疾病的方法多以投喂抗生素、注射疫苗、消毒等方式為主。近年來，由于抗生素濫用造成交叉抗藥性、藥物殘留等，益生菌作為抗生素的重要替代品之一，越來越受到人們的關注。益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可定義為“通過不同的作用機制對宿主或其生存環(huán)境產(chǎn)生有益影響的活性或滅活的微生物”[10]。目前，許多研究已證明益生菌具有促進生長、提高免疫力、增強抗病力等作用，成為最有潛力的抗生素替代品之一[10-12]。

益生菌主要的作用機理為：通過空間和營養(yǎng)物質(zhì)競爭抑制致病菌生長；產(chǎn)生抑菌物質(zhì)排斥致病菌；改善水質(zhì)；提高機體抗氧化和免疫功能；自身提供營養(yǎng)物質(zhì)以及通過產(chǎn)生消化酶促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等[13-14]。研究表明，飼料中添加不同水平的益生菌可提高青魚(Mylopharyngodonpiceus)[15]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[16-19]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[20]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[21]、金頭鯛(Sparusaurata)[13]和點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[7,22]等的生長、消化酶活性、抗氧化酶活性和免疫水平。然而，有關益生菌對珍珠龍膽石斑魚生長、消化酶和抗氧化酶活性等的研究尚未見報道。

酪酸菌(Clostridiumbutyricum)又名丁酸梭菌，是我國農(nóng)業(yè)部于2009年7月批準的新一代微生物飼料添加劑[23]，有關其研究主要集中在人和畜禽陸生養(yǎng)殖動物[24]，目前在水產(chǎn)動物中的研究還少見報道[25-26]。酪酸菌為嚴格厭氧菌，同時因產(chǎn)生芽孢，所以具有高活性、高穩(wěn)定性的特點。此外，它還是對常用抗生素具有耐受性的腸道正常菌群，易與其它益生菌共生，可糾正腸內(nèi)的菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等[27-29]，因此具有較高的研究和應用價值。本研究以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，初步探討了飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對珍珠龍膽石斑魚生長、消化酶活性以及血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響，以期為其在珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌來源

本實驗所使用的酪酸菌(菌株編號：CBYG01)為中國海洋大學水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實驗室篩選、保存的菌種。

1.2 實驗飼料和實驗設計

石斑魚養(yǎng)殖使用的飼料為愛樂配合飼料(ALLER AQUA)，含粗蛋白51%、脂肪12%、灰分1.1%。

研究前期與宏濟堂文旅園區(qū)相關負責人進行多次溝通，包括參觀園區(qū)與面對面訪談，共同籌劃問卷設計與表達形式。確定調(diào)查顧客和企業(yè)員工以分層對比，采用同樣問卷且內(nèi)容涵蓋中醫(yī)藥特色和旅游基礎設施：地理和交通、環(huán)境結構與布局、價格、中醫(yī)藥特色資源、安全與衛(wèi)生、設施與配套、服務水平、文化與形象、總體滿意程度等，這些信息匯總對本研究奠定基礎。問卷調(diào)查在2018年2月完成，收回有效問卷共367份，其中包括員工問卷179份，游客問卷188份。期間還訪談游客和工作人員，收集規(guī)章制度、園區(qū)介紹、游客須知、員工手冊、圖片視頻、微信等內(nèi)容，盡可能全面細致把握信息材料。

處理組飼料：按一定濃度將酪酸菌活菌菌體或發(fā)酵液菌液均勻噴灑在石斑魚基礎飼料的表面，揉搓陰干，再在其表面包裹一層褐藻酸鈉和魚油(比例同對照組飼料)，分別制成酪酸菌活菌菌體添加量1×107cfu/kg(標記為CB1)、1×109cfu/kg(標記為CB2)和1×1011cfu/kg(標記為CB3)以及酪酸菌發(fā)酵液添加量為1×109cfu/kg(標記為CBM)的4種實驗飼料，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

酪酸菌活菌菌體的制備：酪酸菌接種于強化培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉浸膏3 g，硫酸銨1 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.5 g，K2HPO44 g，蒸餾水1 000 mL)中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)24 h，顯微鏡計數(shù)，確定細菌濃度，然后5 000 r/min離心10 min，無菌生理鹽水梯度稀釋制備1×1011、1×109、1×107cfu/kg 的菌懸液。

酪酸菌發(fā)酵液制備：酪酸菌接種于裝有強化培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉浸膏3 g，硫酸銨1 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.5 g，K2HPO44 g，蒸餾水1 000 mL)的5 L三角瓶中，37 ℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)48 h，顯微鏡計數(shù)，確定細菌濃度，5 000 r/min離心10 min然后用0.22 μm濾膜過濾后的發(fā)酵液重懸菌體，制成1×109cfu/kg的菌懸液，其主要成分為酪酸菌及其代謝物。

1.3 實驗魚及飼養(yǎng)管理

本研究所用的珍珠龍膽石斑魚購于山東萊州明波水產(chǎn)有限公司，運回后在玻璃缸水槽中28 ℃水溫條件下暫養(yǎng)15 d。暫養(yǎng)期間，每天8:00和16:00飽食投喂基礎飼料。暫養(yǎng)結束后饑餓24 h，以MS-222(40 mg/L)麻醉，挑選125尾健康、規(guī)格一致的石斑魚(42.91 g± 1.47 g)，隨機分為5組，每組5個重復，每個重復5尾魚，于規(guī)格為(50 cm×30 cm×35 cm)的玻璃缸中養(yǎng)殖60 d。實驗期間，每天8:00和16:00飽食投喂實驗飼料，投喂前后及時收集殘餌和糞便，75 ℃烘干保存。

每天換水一次，換水量為3/4。實驗期間，水溫保持(28±0.5) ℃，鹽度29±1，pH=8.0±0.1，連續(xù)增氧，溶氧保持在5 mg/L以上。

養(yǎng)殖實驗在中國海洋大學鰲山衛(wèi)實驗基地進行，實驗時間為2015年8月23日至10月21日。

1.4 樣品采集及處理

實驗結束后，饑餓24 h，MS-222(40 mg/L)麻醉，稱量并記錄每尾魚的體重。每個處理取5尾魚，用1 mL無菌注射器尾靜脈取血置于1.5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置24 h后，3 000 r/min離心10 min，取上層血清于-80 ℃冰箱保存。然后將魚解剖，取胃和腸道，并將腸道分為前腸和后腸，置于離心管中液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.5 測試指標及測定方法

1.5.1 生長指標 根據(jù)實驗開始和結束時魚的初始體重和末體重，以及實驗過程中統(tǒng)計的投喂量和殘餌量，計算特定生長率(Specific growth rate，SGR)，日攝食量(Food consumption，F(xiàn)C)和食物轉化效率(Food conversion efficiency，F(xiàn)CE)。

特定生長率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%，

日攝食量(FC，g·d-1·ind-1)=Cw/(N·t)，

食物轉化效率(FCE)=(Wt-W0)/Cw×100%。

式中：W0和Wt為魚的初始體重和末體重(g)；Cw為總攝食量(g)；N為魚的數(shù)量；t為實驗時間(d)。

1.5.2 消化酶 稱取適量胃和腸道組織， 并記下其準確重量， 按照組織樣品與生理鹽水 1∶9 的比例加入生理鹽水， 并在冰水浴條件下勻漿， 制成 10% 組織勻漿液，4 ℃條件下 3 000 r/min 離心 10 min， 小心吸取上清液分裝， 進行測定。胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)、脂肪酶(Lipase)、淀粉酶(Amylase)活性以及組織總蛋白含量等指標均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定完成，酶活力單位為U·mgpro-1或U·gpro-1。

1.5.3 血清抗氧化酶和溶菌酶 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)和溶菌酶(Lysozyme，LSZ)等血清酶活性均采用南京建成生物研究所的試劑盒測定，樣品前處理、試劑配制和測定步驟嚴格按照操作說明書執(zhí)行，酶活力單位為U·mL-1。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan's多重比較進行差異顯著性檢驗，并用獨立樣本t檢驗分析了前后腸消化酶活性差異，以P<0.05時為差異顯著，統(tǒng)計結果用平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結果

2.1 生長指標

2.1.1 生長及特定生長率 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚生長的影響見表1。所有處理組珍珠龍膽石斑魚的初始體重與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。CB3處理組石斑魚末體重和特定生長率顯著高于對照組(P<0.05)，而CB1、CB2、CB3、CBM各實驗組之間沒有顯著差異(P>0.05)。隨菌體濃度的增加，酪酸菌菌體添加處理組石斑魚末體重和特定生長率逐漸增大。CBM處理組石斑魚的末體重和特定生長率大于CB1、CB2處理組，小于CB3處理組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.1.2 日攝食量及食物轉化效率 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚日攝食量和食物轉化效率的影響見表1。CB3實驗組石斑魚的日攝食量和食物轉化效率顯著高于對照組(P<0.05)，CB1、CB2、CB3、CBM處理組之間沒有顯著差異(P>0.05)。隨菌體濃度的升高，酪酸菌菌體添加處理組石斑魚日攝食量和食物轉化效率逐漸升高。CBM處理組石斑魚的日攝食量和食物轉化效率高于CB1、CB2處理組，低于CB3處理組，但差異不顯著(P>0.05)。

表1 珍珠龍膽石斑魚的生長、日攝食量和食物轉化效率Table 1 Growth, food consumption and food conversion efficiency of hybrid grouper

注： CB1、CB2、CB3和CBM為分別添加濃度為1×107、1×109和1×1011cfu/kg酪酸菌活菌菌體和1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液飼料投喂的石斑魚，對照為不添加任何益生菌飼料投喂的石斑魚；同一列中標不同字母的數(shù)據(jù)表示相互之間差異顯著(P<0.05)。

Note: CB1, CB2 and CB3 were hybrid grouper fed diet with 1×107, 1×109and 1×1011cfu/kg live cell ofClostridiumbutyricum; CBM was hybrid grouper fed diet with 1×109cfu/kgClostridiumbutyricumfermentation broth; The control was hybrid grouper fed diet without probiotics; Data with different superscripts letters at the same column means significant difference each other (P<0.05).

①Treatments；②Initial body weight；③Final body weight；④Special growth rate；⑤Food consumption；⑥Food conversion efficiency；⑦Control

2.2 消化酶

2.2.1 胃蛋白酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚胃蛋白酶活性的影響見圖1。CB3處理組石斑魚胃蛋白酶活性顯著高于CB1、CB2和對照組(P<0.05)。CBM處理組石斑魚胃蛋白酶活性高于CB1、CB2處理組和對照組，低于CB3處理組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 胰蛋白酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚胰蛋白酶活性的影響見圖2。CB3處理組石斑魚前腸和后腸胰蛋白酶活性均顯著高于對照組和其它實驗組(P<0.05)。對照組和CB1、CB2、CBM處理組之間前后腸胰蛋白酶活性無顯著差異(P>0.05)。對照組和各實驗組石斑魚前腸胰蛋白酶活性均顯著高于后腸胰蛋白酶活性(P<0.01)。

(CB1、CB2、CB3和CBM為分別添加濃度為1×107、1×109和1×1011cfu/kg酪酸菌活菌菌體和1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液飼料投喂的石斑魚，對照為不添加任何益生菌飼料投喂的石斑魚；標有不同字母的數(shù)據(jù)表示相互之間差異顯著(P<0.05)。下同。CB1, CB2 and CB3 were hybrid grouper fed diet with 1×107, 1×109and 1×1011cfu/kg live cell ofClostridiumbutyricum; CBM was hybrid grouper fed diet with 1×109cfu/kgClostridiumbutyricumfermentation broth; Control was hybrid grouper fed diet without probiotics; Data with different letters at the same column means significant difference each other (P<0.05).The same as follows.)

圖1 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚胃蛋白酶活性的影響
Fig.1 Effect of probiotics on the pepsin activity of hybrid grouper

(標有不同大小寫字母分別表示不同處理之間后腸和前腸酶活性差異顯著(P<0.05)，標有雙星號的數(shù)據(jù)表示同一處理前腸和后腸之間酶活性差異極顯著(P<0.01)，單星號表示差異顯著(P<0.05)。圖3、4同圖2。Data with different letters at the same column means significant difference each other (P<0.05). Bars with different lowercase or uppercase letters mean significant difference (P<0.05) in proximal and distal intestine, respectively. Bars with two asterisks mean extremely significant difference (P<0.01) between foreintestine and hindintestine, while one means significant difference (P<0.05). It is same for Fig.3 and Fig.4.)

圖2 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚胰蛋白酶活性的影響
Fig.2 Effects of probiotics on the trypsin of hybrid grouper

2.2.3 脂肪酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚脂肪酶活性的影響見圖3。CB3處理組石斑魚前腸脂肪酶活性顯著高于CB1、CB2和對照組(P<0.05)。CBM處理組石斑魚前腸脂肪酶活性與CB1、CB2、CB3處理組和對照組差異不顯著(P>0.05)。CB3處理組后腸脂肪酶活性顯著高于對照組和CB1處理組(P<0.05)，CBM處理組后腸脂肪酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，但與CB1、CB2和CB3處理組差異不顯著(P>0.05)。

圖3 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚脂肪酶活性的影響Fig.3 Effect of probiotics on the lipase activity of hybrid grouper

2.2.4 淀粉酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚淀粉酶活性的影響見圖4。CB3處理組石斑魚前腸淀粉酶活性顯著高于CB1、CB2和對照組(P<0.05)。CBM處理組石斑魚前腸淀粉酶活性與CB1、CB2、CB3處理組和對照組差異不顯著(P>0.05)。CB1、CB2、CB3和CBM處理組與對照組之間石斑魚后腸淀粉酶活性均無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于前腸淀粉酶活性(P<0.05)。

圖4 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚淀粉酶活性的影響Fig.4 Effect of probiotics on the amylase activity of hybrid grouper

2.3 血清抗氧化酶和溶菌酶

2.3.1 超氧化物歧化酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚血清SOD活性的影響見圖5。CB3和CBM處理組SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，但與CB1、CB2處理組差異不顯著(P>0.05)。

圖5 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚血清超氧化物歧化酶活性的影響Fig.5 Effect of probiotics on the serum superoxide dismutase activity of hybrid grouper

2.3.2 過氧化物酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚血清CAT活性的影響見圖6。CB3處理組CAT活性顯著高于CB1、CB2和對照組(P<0.05)，CBM處理組CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)，CB1、CB2、CBM處理組之間CAT活性差異不顯著(P>0.05)。

圖6 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚血清過氧化物酶活性的影響

2.3.3 谷胱甘肽過氧化物酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚血清GPx活性的影響見圖7。CB2、CB3和CBM處理組GPx活性顯著高于CB1和對照組(P<0.05)，且CB2、CB3、CBM處理組之間GPx活性差異顯著(P<0.05)，活性高低依次為CB3>CBM>CB2。

圖7 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig.7 The effect of probiotics on the serum glutathione peroxidase activity of hybrid grouper

2.3.4 溶菌酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對石斑魚血清LSZ活性的影響見圖8。CB3處理組LSZ活性顯著高于CB1、CB2和對照組(P<0.05)。CBM處理組LSZ活性顯著高于對照組(P<0.05)，但與CB1、CB2、CB3處理組差異不顯著(P>0.05)。

圖8 益生菌添加對珍珠龍膽石斑魚血清溶菌酶活性的影響Fig.8 Effect of probiotics on the serum lysozyme activity of hybrid grouper

3 討論

3.1 酪酸菌對珍珠龍膽石斑魚生長的影響

益生菌增進動物生長性能的作用已受到廣泛研究。張彩云等[30]研究發(fā)現(xiàn)，1‰的酪酸菌能顯著提高斷奶仔豬的平均日增重，當添加量提高到3‰時，料重比顯著下降。賈聰慧等[23]研究表明，飼料中添加108cfu/kg的酪酸菌能顯著提高肉雞的生長性能。Yang等[31]、Zhang等[32]和Liao等[33]均報道飼料中添加合適劑量的酪酸菌可顯著提高肉雞的平均日增重，且促長效果與抗生素添加組無顯著差異。目前，關于酪酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物上的應用研究還少見報道，公開報道僅見于酪酸菌對鮸魚(Miichthysmiiuy)影響的相關研究[25]。Song等[25]發(fā)現(xiàn)1012cfu/g的酪酸菌可顯著提高鮸魚的總增重、相對增重率、食物利用率和特定生長率，且作用效果與酪酸菌劑量呈正相關。在本研究中，添加1×1011cfu/kg的酪酸菌CBYG01活菌菌體顯著提高了石斑魚的末體重、特定生長率、日攝食量和食物轉化效率。然而，也有少數(shù)研究表明，飼料添加酪酸菌對動物的生長性能并不產(chǎn)生影響。例如，Zhang等[34]報道酪酸菌對肉雞的生長并無顯著影響。這些結果的差異性可能與動物種類、基礎飼料、益生菌添加劑量和動物自身的健康狀況有關[23,33,35]。從現(xiàn)有的報道看，酪酸菌在水產(chǎn)動物上應用的適宜劑量可能要遠高于陸生動物，例如在豬和肉雞上的適宜添加量多在108～109cfu/kg，而在鮸魚、珍珠龍膽石斑魚和凡納濱對蝦(Litopenaeusvanamei，未發(fā)表數(shù)據(jù))上適宜的濃度則達1011～1012cfu/kg。酪酸菌促進動物生長的準確作用機制尚無法確定，但可能與其生物學特性有密切關系。酪酸菌能夠產(chǎn)生孢子，耐受胃液、膽汁液和消化液的作用，從而有利于其在腸道內(nèi)定植，還能產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制病原菌及腐敗菌在腸道內(nèi)異常增殖而促進有益菌的增殖發(fā)育，進而糾正腸道菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[36-37]。同時，酪酸菌主要代謝產(chǎn)物丁酸對維持動物腸道形態(tài)結構的完整性和促進腸道細胞增殖與成熟發(fā)揮重要作用[23]。此外，酪酸菌產(chǎn)生的氨基酸、B族維生素和維生素K，能促進VE吸收，補充必要的營養(yǎng)物質(zhì)；分泌淀粉酶、糖苷酶和纖維素酶等酶類促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[23-24,36-37]。

3.2 酪酸菌對珍珠龍膽石斑魚消化酶活性的影響

研究表明，在飼料中添加適量的益生菌如酵母、芽孢桿菌和乳酸菌等，可提高水產(chǎn)動物的消化酶活性，從而改善魚類對飼料的消化，提高了飼料的利用水平[41]。Tovar-Ramirez等[42]報道，飼料中添加活性酵母(Debaryomyceshansenii)有效提高了歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)幼魚的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶活性。而Wang和Xu[20]則發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌(Bacillussp.)作為益生菌添加劑能顯著提高鯉魚(Cyprinuscarpio)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶活性。Suzer等[13]也報道了飼料中添加乳酸菌(Lactobacillusspp.)能顯著提高了金頭鯛(Sparusaurata)幼魚腸道堿性磷酸酶、亮氨酸-丙氨酸肽酶和胰腺蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。本研究結果表明，添加1×1011cfu/kg的酪酸菌活菌顯著提高了石斑魚的胃蛋白酶、腸道胰蛋白酶、腸道脂肪酶和前腸淀粉酶的活性。由此推測，添加酪酸菌同添加酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌相似，可以有效提高魚類消化器官的消化酶活性，促進食物大分子分解為易于被細胞吸收的小分子，從而提高對蛋白、脂肪和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。酪酸菌是腸道有益菌群，在消化道中定植后萌發(fā)生長成具有代謝活性的“營養(yǎng)型”細胞后，可以調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善腸道微生態(tài)環(huán)境以及腸道的生理活動。同時，微生物通過在腸道內(nèi)分泌多種酶類，進入宿主腸道的“酶池”中，從而提高宿主腸道消化酶活性[41]。值得注意的是，在腸道不同部位，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性存在明顯差異。Wang[17]報道了在草魚(Ctenopharyngodonidella)魚苗的益生菌研究中發(fā)現(xiàn)，草魚前腸蛋白酶活性顯著高于后腸，而后腸纖維素酶活性則顯著高于前腸。從本研究結果看，石斑魚前腸胰蛋白酶活性顯著高于后腸，后腸淀粉酶活性顯著高于前腸，前腸脂肪酶活性也高于后腸，這表明不同的腸道部位對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力可能存在差異，如前腸可能對蛋白和脂肪等物質(zhì)的消化能力高于后腸，而后腸可能對淀粉等物質(zhì)的消化能力高于前腸，這種差異是否與珍珠龍膽石斑魚的肉食性有關尚需進一步研究確定。

3.3 酪酸菌對珍珠龍膽石斑魚血清抗氧化和溶菌酶活性的影響

細胞在正常代謝過程中會產(chǎn)生活性氧，而細胞抗氧化防御系統(tǒng)會及時清理細胞內(nèi)的自由基，二者一般處于動態(tài)平衡中。但當體內(nèi)自由基過多時，就會對細胞DNA、蛋白和細胞膜脂類造成損傷[38-39]。超氧化物歧化酶、過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶類，主要功能是清除體和分解體內(nèi)的自由基。已有的研究表明，乳酸菌和雙歧桿菌作為益生菌添加劑具有抗氧化功能，能夠抑制脂質(zhì)氧化和活性氧累積，從而減弱動物氧化脅迫[39]。然而，有關酪酸菌添加對水產(chǎn)動物抗氧化功能影響的研究還尚未見報道。本研究結果表明，添加1×1011cfu/kg的酪酸菌菌體和1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液能顯著提高血清抗氧化酶活性。研究表明，酪酸菌能夠產(chǎn)生 T-SOD 和還原型輔酶Ⅰ/還原型輔酶Ⅱ(NADH /NADPH) 過氧化物酶，可以直接清除體內(nèi)活性氧[23,40]。此外，其代謝產(chǎn)物丁酸和氫氣則具有通過增加抗氧化酶活性和減少活性氧產(chǎn)物，進而調(diào)節(jié)氧化脅迫的功能。酪酸菌抗氧化作用的機制可能與丁酸和氫氣影響抗氧化酶的基因表達、減少活性氧產(chǎn)生、刺激機體免疫系統(tǒng)減少炎癥反應和氧化損傷等原因有關[33]。

溶菌酶是脊椎動物和非脊椎動物免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分之一，能水解革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖而使之細胞裂解，從而殺滅病原微生物。它存在于大多數(shù)魚類的黏液、淋巴組織、血清和其它組織液中，在病原菌入侵宿主時，發(fā)揮重要的防御功能[25]。很多研究表明，魚類攝入添加益生菌的飼料時，其血清溶菌酶活性會升高[7,25-26]。Song等[25]在其研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酪酸菌可顯著提高鮸魚血清溶菌酶活性，且隨添加劑量的增加溶菌酶活性也呈升高趨勢。Pan等[26]也發(fā)現(xiàn)鮸魚攝食有活性或滅活的酪酸菌添加的飼料之后，黏液和血清中溶菌酶活性均顯著升高。本研究中，添加1×109、1×1011cfu/kg的酪酸菌活菌菌體以及1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液后，石斑魚血清溶菌酶活性均顯著升高，表明酪酸菌能夠有效提高石斑魚的非特異性免疫反應。

4 結語

飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液可以促進珍珠龍膽石斑魚的生長，提高消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶的活性。酪酸菌活菌菌體的最佳添加量為1×1011cfu/kg，而酪酸菌發(fā)酵液的最佳添加濃度有待進一步研究確定。

[1] Choon Looi Ch’ng Shigeharu Senoo. Egg and Larval Development of a New Hybrid Grouper, Tiger GrouperEpinephelusfuscoguttatus×Giant GrouperE.lanceolatus[J]. Aquaculture Science, 2008, 56(4): 505-512.

[2] 梁華芳, 黃東科, 吳耀華, 等. 溫度和鹽度對龍虎斑存活與攝食的影響[J]. 廣東海洋大學學報, 2013(4): 22-26. Liang H F, Huang D K, Wu Y H, et al. Effects of Temperature and Salinity on Survival and Food Intake of Hybrid Grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatus♂) [J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2013(4): 22-26.

[3] 梁華芳, 黃東科, 吳耀華, 等. 溫度和鹽度對龍虎斑(♀×♂)耗氧率和排氨率的影響[J]. 漁業(yè)科學進展, 2014, 35(2): 30-34. Liang H F, Huang D K, WU Y H, et al. Effects of temperature and salinity on oxygen consumption and ammonia excretion of hybrid grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatus♂) [J]. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(2): 30-34.

[4] Luo Y, Wu X, Li W, et al. Effects of Different Corn Starch Levels on Growth, Protein Input, and Feed Utilization of Juvenile Hybrid Grouper (maleEpinepheluslanceolatus×femaleE.fuscoguttatus) [J]. North American Journal of Aquaculture, 2016, 78(2): 168-173.

[5] De M, Mazlan A G, Bakar Y, et al. Optimum temperature for the growth form of Tiger grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀) × Giant grouper (E.lanceolatus♂) hybrid [J]. Sains Malaysiana, 2016, 45(4): 541-549.

[6] 本刊綜合. 養(yǎng)殖業(yè)新秀——珍珠龍膽石斑魚[J]. 農(nóng)家之友, 2016(2): 50. Comprehensive journal. The breeding rookie-hybrid grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatus♂) [J]. Friends of Farmhouse, 2016(2): 50.

[7] Son V M, Chang C C, Wu M C, et al. Dietary ad ministration of the probiotic,Lactobacillusplantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouperEpinepheluscoioides[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2009, 26(5): 691-698.

[8] Harikrishnan R, Balasundaram C, Heo M S. Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology [J]. Aquaculture, 2010, 309(1-4): 1-14.

[9] Harikrishnan R, Balasundaram C, Heo M S. Fish health aspects in grouper aquaculture [J]. Aquaculture, 2011, 320(s1-2): 1-21.

[10] Zorriehzahra M J, Delshad S T, Adel M, et al. Probiotics as beneficial microbes in aquaculture: an update on their multiple modes of action: a review [J]. Veterinary Quarterly, 2016， 36(4): 228-241.

[11] Ayyat M S, Labib H M, Mahmoud H K. A probiotic cocktail as a growth promoter in nile tilapia (Oreochromisniloticus) [J]. Journal of Applied Aquaculture, 2014, 26(3): 208-215.

[12] Tan T H, Chan K G, Lee L H, et al. Streptomyces bacteria as potential probiotics in aquaculture [J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 79.

[13] Suzer C, ?oban D, Kamaci H O, et al.Lactobacillusspp. bacteria as probiotics in gilthead sea bream (Sparusaurata) larvae: Effects on growth performance and digestive enzyme activities [J]. Aquaculture, 2008, 280(1-4): 140-145.

[14] Hai N V. The use of probiotics in aquaculture[J]. Journal of Applied Microbiology, 2015, 119(4): 917-935.

[15] 沈斌乾, 陳建明, 郭建林, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚生長、消化酶活性和魚體組成的影響[J]. 水生生物學報, 2013, 37(1): 48-53. Shen B Q, Chen J M, Guo J L, et al. Effect of addingBacillussubtilisto diets on growth performance, digestive enzymes activity and body composition of fingerling black carp (Mylopharyngodonpiceus) [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(1): 48-53.

[16] 沈文英, 李衛(wèi)芬, 梁權, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2011, 23(5): 881-886. Shen W Y, Li W F, Liang Q, et al. Effects of dietaryBacillussubtilison growth performance, immunity and antioxidant function of grass carp (Ctenopharyngodonidellus) [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2011, 23(5): 881-886.

[17] Wang Y. Use of probioticsBacilluscoagulans,RhodopseudomonaspalustrisandLactobacillusacidophilusas growth promoters in grass carp (Ctenopharyngodonidella) fingerlings [J]. Aquaculture Nutrition, 2011, 17(2): 372-378.

[18] Wu Z X, Feng X, Xie L L, et al. Effect of probioticBacillussubtilis, Ch9 for grass carp,Ctenopharyngodonidella, (Valenciennes, 1844), on growth performance, digestive enzyme activities and intestinal microflora [J]. Journal of Applied Ichthyology, 2012, 28(5): 721-727.

[19] 桂琳, 王曉清, 康銀, 等. 一種復合益生菌對草魚生長和抗氧化功能的影響[J]. 淡水漁業(yè), 2015, 45(5): 83-87. Gui L, Wang X Q, Kang Y, et al. Effects of one compound probiotics on growth and antioxidant function ofCtenopharyngodonidellus[J]. Freshwater Fisheries, 2015, 45(5): 83-87.

[20] Wang Y, Xu Z. Effect of probiotics for common carp (Cyprinuscarpio) based on growth performance and digestive enzyme activities [J]. Animal Feed Science & Technology, 2006, 127(4): 283-292.

[21] 何偉聰, 董曉慧, 譚北平, 等. 益生菌對軍曹魚幼魚生長性能、消化酶和免疫酶活性的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2015, 27(12): 3821-3830. He W C, Dong X H, Tan B P, et al. Effects of probiotics on growth performance, digestive enzyme and immune enzyme activities of juvenile cobia (Rachycentroncanadum) [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(12): 3821-3830.

[22] Sun Y Z, Yang H L, Ma R L, et al. Probiotic applications of two do minant gutBacillusstrainswith antagonistic activity improved the growth performance and immune responses of grouperEpinepheluscoioides[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2010, 29(5): 803-809.

[23] 賈聰慧, 楊彩梅, 曾新福, 等. 丁酸梭菌對肉雞生長性能、抗氧化能力、免疫功能和血清生化指標的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2016, 28(3): 908-915. Jia C H, Yang C M, Zeng X F, et al. Effects ofClostridiumbutyricumon growth performance, antioxidant capacity, immune function and serum biochemical parameters of broilers [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(3): 908-915.

[24] 張善亭, 史燕, 張淑麗, 等. 丁酸梭菌的研究應用進展[J]. 生物技術通報, 2013(9): 27-33. Zhang S T, Shi Y, Zhang S L, et al. Progress on the studies and application ofClostridiumbutyricum[J]. Biotechnology Bulletin, 2013(9): 27-33.

[25] Song, Zeng-fu, Tian-xing, et al. Effects of dietary supplementation withClostridiumbutyricumon the growth performance and humoral immune response inMiichthysmiiuy[J]. Journal of Zhejiang University-Science B, 2006, 7(7): 596-602.

[26] Pan X, Wu T, Song Z, et al. Immune responses and enhanced disease resistance in Chinese drum,Miichthysmiiuy(Basilewsky), after oral ad ministration of live or dead cells ofClostridiumbutyriumCB2 [J]. Journal of Fish Diseases, 2008, 31(9): 679-686.

[27] 唐寶英, 朱曉慧. 新一代微生態(tài)制劑——酷酸菌的研究和開發(fā)前景[J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2000, 12(5): 297. Tang B Y, Zhu X H. A new generation of probiotics-Research and development prospect ofClostridiumbutyricum[J]. Chinese Journal of Microecology, 2000, 12(5): 297.

[28] 王永軍. 動物微生態(tài)制劑酪酸菌的研究與發(fā)展[J]. 中國飼料添加劑, 2006(3): 18-19. Wang Y J. Research and development of animal probiotics,Clostridiumbutyricum[J]. China Feed Addictive, 2006(3): 18-19.

[29] 宋會儀, 吳天星. 酪酸菌微生態(tài)制劑的生物學功能及在飼料中的應用[J]. 飼料工業(yè), 2006, 27(12): 10-11. Song H Y, Wu T X. Biological function ofClostridiumbutyricumand its application in feed industry [J]. Feed Industry, 2006, 27(12): 10-11.

[30] 張彩云, 劉來亭, 杜靈廣, 等. 酪酸芽孢桿菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和血清生化指標的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2009, 45(13): 43-45. Zhang C Y, Liu L T, Du G L, et al. Effects ofClostridiumbutyricumon the production performance and serum biochemical indexes of weaned piglets [J]. Chinese Journal of Animal Science, 2009, 45(13): 43-45.

[31] Yang C M, Cao G T, Ferket P R, et al. Effects of probiotic,Clostridiumbutyricum, on growth performance, immune function, and cecal microflora in broiler chickens [J]. Poultry Science, 2012, 91(9): 2121-2129.

[32] Zhang L, Cao G T, Zeng X F, et al. Effects ofClostridiumbutyricumon growth performance, immune function, and cecal microflora in broiler chickens challenged withEscherichiacoliK88 [J]. Poultry Science, 2014, 93(1): 46-53.

[33] Liao X D, Ma G, Cai J, et al. Effects ofClostridiumbutyricumon growth performance, antioxidation, and immune function of broilers [J]. Poultry Science, 2015, 94(4): 662-667.

[34] Zhang B, Yang X, Guo Y, et al. Effects of dietary lipids andClostridiumbutyricumon the performance and the digestive tract of broiler chickens [J]. Archives of Animal Nutrition, 2011, 65(4): 329-339.

[35] Hossain M M, Begum M, Kim I H. Effect ofBacillussubtilis,ClostridiumbutyricumandLactobacillusacidophilusendospores on growth performance, nutrient digestibility, meat quality, relative organ weight, microbial shedding and excreta noxious gas emission in broilers [J]. Veterinární Medicína, 2015, 60(2): 77-86.

[36] 劉亭婷, 王曉霞. 酪酸梭菌的作用機理及其在動物生產(chǎn)中的應用[J]. 中國飼料, 2012(4): 9-11. Liu T T, Wang X X. The mechanism ofClostridiumbutyricumand its application in animal production [J]. China Feed, 2012(4): 9-11.

[37] 易中華. 飼用微生態(tài)制劑丁酸梭菌的研究與應用進展[J]. 飼料研究, 2012(2): 14-17. Yi Z H. Progress on the studies and application ofClostridiumbutyricum[J]. Feed Research, 2012(2): 14-17.

[38] Yu B P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species [J]. Physiological Reviews, 1994, 74(1): 139-162.

[39] Zhuang S, Jiang F B, Jia Z X, et al.Clostridiumbutyricumcan be used as a potential alternative for the antibiotic in Cherry Valley ducks [J]. Journal of Animal & Plant Sciences, 2015, 25(5): 1227-1232.

[40] Kawasaki S, Nakagawa T, Nishiyama Y, et al. Effect of oxygen on the growth ofClostridiumbutyricum, (type species of the genusClostridium), and the distribution of enzymes for oxygen and for active oxygen species in Clostridia [J]. Journal of Fermentation & Bioengineering, 1998, 86(4): 368-372.

[41] 宋增福. 丁酸梭菌C_2菌株對鮸魚腸道微生態(tài)調(diào)控作用與機理研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2006. Song Z F. Study of Manipulation and Approach to the Mechanism ofClostridiumbutyricummStrain C2on the Intestinal Microecology inMiichthysmiiuy[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2006.

[42] Tovar D, Zambonino J, Cahu C, et al. Effect of live yeast incorporation in compound diet on digestive enzyme activity in sea bass (Dicentrarchuslabrax) larvae [J]. Aquaculture, 2002, 204(1): 113-123.

Abstract:Clostridiumbutyricumis a new potential probiotic bacterium with important physiological function, but fewer studies about it in aquatic organisms have been done. This study investigated the effects of dietary supplement ofC.butyricumCBYG01 on the growth and activities of digestive and serum antioxidant enzymes and lysozyme of hybrid grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂). Four treatments were designed,i.e., hybrid grouper fed diet with 1×107, 1×109and 1×1011cfu/kg live cells ofC.butyricum(CB1, CB2 and CB3), respectively; hybrid grouper fed diet with 1×109cfu/kg C. butyricum fermentation broth (CBM); and hybrid grouper fed diet without probiotics (Control). After 60 days of feeding trail, the body weight, specific growth rate, food consumption and food conversion efficiency of fish in CB3 were significantly higher than those of control (P<0.05) as well as the pepsin, trypsin, lipase activities and amylase activity in proximal intestine. The pepsin activity, lipase and amylase activities in proximal intestine of fish in CB3 were significantly higher relative to CB1 and CB2 (P<0.05), while which were not significantly different with those in CBM (P>0.05). The superoxide dismutase of fish in CB3 was significantly higher than that of control (P<0.05), the glutathione peroxidase, catalase and lysozyme activities were significantly higher than those of CB1, CB2 and control (P<0.05), while the superoxide dismutase, catalase and lysozyme activities were not significantly different with those of CBM (P>0.05). The glutathione peroxidase and lysozyme activities of fish in CB2 were significantly higher in comparison with control (P<0.05). These findings indicated thatC.butyricum-supplementation could improve the growth and the activities of digestive and serum antioxidant enzymes and lysozyme of hybrid grouper, and the optimal dosage was 1×1011cfu/kg.

Key words:Epinephelusfuscoguttatus(♀) ×E.lanceolatus(♂);Clostridiumbutyricum; growth; digestive enzyme; antioxidant enzyme; lysozyme

責任編輯 朱寶象

Effects of Dietary Supplementation ofClostridiumbutyricumon the Growth and Activities of Digestive and Serum Antioxidant Enzymes and Lysozyme of Hybrid Grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)

HE Rui-Peng, FENG Jie, TIAN Xiang-Li, DONG Shuang-Lin, LI Hai-Dong

(The Key Laboratory of Mariculture (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China)

S917.1

A

1672-5174(2017)11-015-09

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160400

何瑞鵬， 奉杰， 田相利， 等. 酪酸菌對珍珠龍膽石斑魚生長、消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2017, 47(11)： 15-23.

HE Rui-Peng, FENG Jie, TIAN Xiang-Li, et al. Effects of dietary supplementation ofClostridiumbutyricumon the growth and activities of digestive and serum antioxidant enzymes and lysozyme of hybrid grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀ ×E.lanceolatus♂) [J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(11)： 15-23.

山東省杰出青年基金項目(JQ201009)；廣東省海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(GDHY2013-B03-005)； 青島市民生科技計劃項目(15-9-2-96-NSH)資助 Supported by the Program for Excellent Youth Foundation of Shandong Province (JQ201009); The Specialized Project of Regional Demonstration for the Innovation and Development of Marine Economy of Guangdong Province (GDHY2013-B03-005); The Scientific and Technical Programs for People's Livelihood of Qingdao (15-9-2-96-NSH)

2016-12-07；

2017-03-27

何瑞鵬(1988-)，男，博士生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學研究。E-mail:heruip.happy@163.com

** 通訊作者：E-mail:xianglitian@ouc.edu.cn