分子標(biāo)記在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

王慶軍，郝兆祥，羅華，趙麗娜，畢潤(rùn)霞，趙亞偉

(1.棗莊市石榴研究中心，山東 棗莊 277300；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

分子標(biāo)記在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

王慶軍1，2，郝兆祥1，羅華1，趙麗娜1，畢潤(rùn)霞1，趙亞偉1

(1.棗莊市石榴研究中心，山東 棗莊 277300；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

石榴為我國重要的漿果樹種之一，種質(zhì)資源豐富，全世界范圍內(nèi)有1 000多個(gè)石榴品種及野生型品種。本文綜述了國內(nèi)外分子標(biāo)記在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為該技術(shù)用于石榴種質(zhì)資源的收集、分類、保存、遺傳多樣性評(píng)價(jià)及親緣關(guān)系鑒定等研究提供更加科學(xué)的手段。

石榴；分子標(biāo)記；遺傳多樣性；種質(zhì)資源

AbstractPomegranate (PunicagranatumL.) is one of the important berry tree species in China, and its germplasm resources are abundant. There are more than 1 000 pomegranate cultivars and wild cultivars in the world. The current progresses at home and abroad in the application of molecular marker in pomegranate germplasm genetic diversity research were reviewed in this study. The aim of the study was to provide more scientific references for the collection, classification, preservation, genetic diversity evaluation and genetic relationship identification of pomegranate germplasm resources.

KeywordsPunicagranatumL.; Molecular marker; Genetic diversity; Germplasm

石榴(PunicagranatumL．)為石榴科(Punicaceae)、石榴屬(PunicaL．)落葉灌木或小喬木，在我國南方則為常綠灌木或小喬木，起源于伊朗、土庫曼斯坦和印度北部等地區(qū)，向東傳播到東亞等國，向西傳播到地中海地區(qū)及南、北美洲各適生地[1,2]。石榴具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值、觀賞價(jià)值、文化價(jià)值等，越來越受到消費(fèi)市場(chǎng)的青睞，國內(nèi)外石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[3]。石榴在長(zhǎng)期的傳播和栽培過程中因基因突變、天然雜交、實(shí)生、分株、嫁接等原因形成了許多變異資源，極大地豐富了石榴的遺傳多樣性。到目前為止，全世界范圍內(nèi)有1 000多個(gè)石榴品種及野生型品種[4]。但石榴品種分類模糊不清，分類標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，給石榴種質(zhì)資源收集、保存、評(píng)價(jià)、創(chuàng)新等帶來不便[5]。除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生物化學(xué)標(biāo)記等技術(shù)在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究上的廣泛應(yīng)用外，近年來，分子標(biāo)記技術(shù)在石榴上的應(yīng)用研究也快速發(fā)展。分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核酸序列變異為基礎(chǔ)的新型遺傳標(biāo)記，是DNA分子水平遺傳多態(tài)性的直接反映。分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相比，是對(duì)基因的直接反映，不受外界環(huán)境等因素的影響，在植物生長(zhǎng)的任何時(shí)期、任何部位都可檢測(cè)到，不存在表達(dá)與否的問題，且標(biāo)記位點(diǎn)極多，多態(tài)性豐富，檢測(cè)方法迅速、簡(jiǎn)單，結(jié)果重復(fù)性好[6，7]。目前，RAPD、AFLP、SSR、SRAP等分子標(biāo)記已在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究上得到廣泛應(yīng)用。本文將系統(tǒng)介紹當(dāng)前分子標(biāo)記主要類型及特征，分別對(duì)常用的5種分子標(biāo)記(RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP)在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為石榴種質(zhì)資源收集、保存、分類、遺傳多樣性及親緣關(guān)系等方面研究提供可靠有效的手段參考。

1 RAPD分子標(biāo)記

RAPD(random amplified polymorphic DNA)分子標(biāo)記即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記,是由Willimas和Welsh等在1990年建立起來的一種以PCR技術(shù)為核心的新型分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，其采用隨機(jī)的核苷酸序列為引物(通常以10個(gè)核苷酸為引物)，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，形成不同大小的DNA片段，用于檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性[8]。由于其引物的設(shè)計(jì)具有隨機(jī)性、DNA需要量少、技術(shù)簡(jiǎn)單、分析速度快、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是國內(nèi)外石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中使用最多的分子標(biāo)記技術(shù)之一(表1)。

在國內(nèi)，盧龍斗等[9]以我國云南、安徽、河南等地的55份石榴栽培種質(zhì)為試驗(yàn)材料，利用篩選出的15條多態(tài)性及重復(fù)性較好的引物進(jìn)行RAPD研究，共擴(kuò)增出125條帶，其中多態(tài)性條帶92條，多態(tài)性百分率達(dá)73.60%，表明種質(zhì)間具有豐富變異。品種間的遺傳距離為0.0889～0.9808，對(duì)55份材料進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看，在遺傳距離4.0處把55份材料分為4個(gè)類群，從基因水平上揭示了石榴種質(zhì)之間的親緣關(guān)系。將聚類結(jié)果與形態(tài)特征中的花色、重萼或重瓣等分類結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，與形態(tài)特征分類具有一定的差異，與依據(jù)花色及果味進(jìn)行的分類無相關(guān)性，卻與依據(jù)瓣型進(jìn)行的分類存在一定的相關(guān)性。熱娜·卡司木等[10]采用RAPD技術(shù)對(duì)新疆23份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系鑒定等研究，在50條10 bp隨機(jī)引物中篩選出多態(tài)性高的7條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出88個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為61個(gè)，多態(tài)性百分率達(dá)69.00%。對(duì)23份材料的Nei相關(guān)系數(shù)進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看，在遺傳距離0.848處把23份材料分為5個(gè)類群， RAPD結(jié)果與通過風(fēng)味進(jìn)行的品種分類存在一定相關(guān)性，但也未完全支持酸、酸甜和甜3類的品種劃分方法。研究結(jié)果表明，即使父、母本相同，其石榴品種間的遺傳多態(tài)性也存在明顯差異，具有豐富的遺傳多樣性。馬麗等[11]采用RAPD技術(shù)對(duì)38份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的20條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出146個(gè)DNA位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為109個(gè)，多態(tài)性百分率達(dá)74.60%。品種間的遺傳相似系數(shù)為0.45～1.00，對(duì)38份材料進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看，在遺傳相似系數(shù)0.58處把38份材料分為4個(gè)類群，結(jié)果顯示，品種間的親緣關(guān)系與形態(tài)學(xué)和地理分布沒有明顯相關(guān)性。利用20條RAPD引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)全部品種進(jìn)行主坐標(biāo)聚類分析，從主坐標(biāo)二維聚類圖可以看出，38份材料分為兩大類，主坐標(biāo)分析結(jié)果與UPGMA的聚類結(jié)果具有一定差異。以上研究都表明，采用RAPD技術(shù)可以把供試材料劃分為不同類群，但楊榮萍等[12]采用RAPD技術(shù)對(duì)云南25份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，從128條隨機(jī)引物中篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的12條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出110條條帶, 平均每個(gè)引物9.17條條帶，多態(tài)性百分率達(dá)71.80%，擴(kuò)增結(jié)果表明，25份石榴品種間存在一定的親緣關(guān)系。品種間的遺傳距離為0.027～0.342，對(duì)25份材料進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看，25份云南石榴品種的遺傳背景較復(fù)雜且品種間具有豐富變異，難以劃分類群。聚類結(jié)果與生產(chǎn)上根據(jù)風(fēng)味、花色、皮色、籽粒顏色、核軟硬程度及栽培目的等性狀的分類結(jié)果不一致。張彥蘋等[13]以16份石榴種質(zhì)為試驗(yàn)材料，利用篩選出的10條多態(tài)性及重復(fù)性較好的引物進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果顯示，石榴遺傳多樣性豐富，說明可以通過RAPD分子標(biāo)記對(duì)石榴種質(zhì)進(jìn)行分子水平的種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析。

在國外，Sarkhosh等[14]采用RAPD技術(shù)對(duì)24個(gè)伊朗石榴品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，從100個(gè)隨機(jī)十聚體引物中篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的16條RAPD引物，對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出178條條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出11.13條條帶，其中多態(tài)性條帶有102條，多態(tài)性百分率達(dá)57.30%。對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)及聚類分析，遺傳相似性系數(shù)為0.29～0.89，在60%的遺傳相似性處，將試驗(yàn)材料分為4個(gè)類群。Masoud等[15]采用RAPD技術(shù)對(duì)10個(gè)石榴品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的40條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出2 050條條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出51.25條條帶，其中215條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率達(dá)10.50%，遺傳相似性系數(shù)為0.36～0.86，表明RAPD分子標(biāo)記是進(jìn)行石榴遺傳多樣性分析的有效工具，特別是出現(xiàn)了特定條帶，特定條帶可以更好地區(qū)分不同的品種，也顯示RAPD分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果具有不一致性。Shinde等[16]采用RAPD技術(shù)對(duì)8份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的5條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出28條條帶，其中多態(tài)性條帶為25個(gè)，多態(tài)性百分率達(dá)89.28%。5條引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增條帶數(shù)為4～7條，品種間的遺傳相似系數(shù)為0.32～0.72，平均遺傳相似系數(shù)為0.61。Sarkhosh、Masoud、Shinde等各自研究都表明，石榴品種具有豐富的遺傳多樣性，RAPD技術(shù)可有效運(yùn)用于石榴品種的遺傳多樣性分析。Sarkhosh等[17]對(duì)來自伊朗的21份不同基因型的軟籽石榴材料，通過37個(gè)形態(tài)性狀分析與采用RAPD技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的14個(gè)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出146條條帶，其中43條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率達(dá)29.45%，基因型間的遺傳相似系數(shù)為0.13～1.00，基于品種果實(shí)性狀的分類與分子標(biāo)記分類兩者間無明顯的相關(guān)性(r=-0.36)。Zamani等[18]采用RAPD技術(shù)與形態(tài)學(xué)性狀分析了伊朗北部50個(gè)石榴品種，這50個(gè)石榴品種包括37個(gè)野生品種、12個(gè)栽培品種及1個(gè)外地品種。從形態(tài)學(xué)特征分析表明，果實(shí)直徑、花青素指數(shù)、可溶性固形物、可滴定酸度、籽粒、籽粒硬度、果味及果皮厚度等為多態(tài)性主要指標(biāo)。RAPD技術(shù)擴(kuò)增出229條條帶，其中174條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率達(dá)76.90%，遺傳相似系數(shù)為0.15～0.78，平均遺傳相似系數(shù)為0.42，表明遺傳多樣性豐富，但形態(tài)學(xué)性狀與RAPD分子標(biāo)記之間的相關(guān)性較低(r=0.45)。Sarkhosh、Zamani等各自研究都表明，基于某些形態(tài)學(xué)性狀的分類與分子標(biāo)記分類間無明顯的相關(guān)性。Hasnaoui等[19]采用RAPD技術(shù)對(duì)12個(gè)突尼斯石榴品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，從12個(gè)引物中篩選出多態(tài)性及重復(fù)性較好的4個(gè)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出29條條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出7.25條，4個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在3～11條，其中多態(tài)性條帶24條，多態(tài)性百分率達(dá)82.76%。品種間的遺傳相似系數(shù)為0.042～0.792，平均遺傳相似系數(shù)為0.384，RAPD分類結(jié)果與石榴品種的地理來源無關(guān)。

表1 RAPD分子標(biāo)記應(yīng)用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的情況

注：GS為遺傳相似系數(shù)；GD為遺傳距離，下表同。

2 AFLP分子標(biāo)記

AFLP(amplified fragment length polymorphism)分子標(biāo)記即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，是由Zabeau和Vos在1993年發(fā)明的以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)需經(jīng)DNA提取、酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、變性聚丙烯酞胺凝膠電泳等步驟, 產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不同的多態(tài)性帶型[6]。AFLP分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、技術(shù)精準(zhǔn)高效、DNA量少、不需預(yù)知DNA序列信息等優(yōu)點(diǎn)，目前在對(duì)石榴基因組序列等信息缺乏了解的情況下，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)是石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的一種有效手段(表2)[20-22]。

在國內(nèi)，趙麗華等[23]采用AFLP技術(shù)對(duì)四川和云南的42個(gè)石榴品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，從64對(duì)引物中篩選出多態(tài)性好的5對(duì)引物進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，共擴(kuò)增出362條條帶，其中多態(tài)性條帶有235條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出72.4條條帶和47條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)65.66%，平均觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均Nei’s基因多樣度(H)和平均香農(nóng)信息指數(shù)(I)分別為1.6566、1.2607、0.1603和0.2531。品種間的遺傳相似系數(shù)為0.7127～0.9254，平均為0.8142。通過聚類分析，在遺傳相似性系數(shù)為0.8200時(shí)，可將試驗(yàn)材料分為4個(gè)類群。研究結(jié)果表明，四川和云南石榴品種資源間具有較豐富的遺傳多樣性。尤其隨著熒光標(biāo)記的使用，AFLP技術(shù)變得更簡(jiǎn)單快速。Yuan等[24]采用熒光標(biāo)記AFLP技術(shù)對(duì)我國山東、河南、陜西等6個(gè)栽培主產(chǎn)區(qū)石榴群體的85個(gè)品種類型進(jìn)行遺傳多樣性分析，8對(duì)引物在種級(jí)水平擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為135～185條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶158.25條，多態(tài)性條帶比率為62.5%～86.11%，平均為73.26%，表明中國石榴的遺傳多樣性較高，石榴品種間的遺傳多樣性高于群體水平。對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行聚類分析，來自同一區(qū)域的多數(shù)品種聚為一類。苑兆和等[25]利用熒光AFLP技術(shù)對(duì)山東25個(gè)石榴品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，從64對(duì)引物中篩選出多態(tài)性好、譜帶清晰的8對(duì)引物進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，共擴(kuò)增出1 728條帶，多態(tài)性條帶為70～126條，多態(tài)性條帶共722條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出216條條帶和90.25條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶比率41.78%，平均觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均Nei’s基因多樣度(H)和平均香農(nóng)信息指數(shù)(I)分別為1.4178、1.1874、0.1133和0.1752。通過聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.786時(shí)，可將試驗(yàn)材料分為4個(gè)類群。研究結(jié)果表明，山東石榴具有豐富的遺傳多樣性。

表2 AFLP分子標(biāo)記應(yīng)用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的情況

注：Na為平均觀測(cè)等位基因；Ne為平均有效等位基因數(shù)；H為平均Nei’s基因多樣度；I為平均香農(nóng)信息數(shù)，下表同。

在國外，Jbir等[26]采用AFLP技術(shù)對(duì)34份突尼斯石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用篩選出的多態(tài)性好的6對(duì)引物進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，共擴(kuò)增出345條條帶，其中多態(tài)性條帶為327條，多態(tài)性比率達(dá)94.78%，研究結(jié)果表明，突尼斯石榴品種遺傳多樣性很豐富，且AFLP標(biāo)記區(qū)分品種具有很高的可靠性。Moslemi等[27]采用AFLP技術(shù)對(duì)來自4個(gè)群體67份伊朗石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用篩選出的多態(tài)性好的8對(duì)引物進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，共擴(kuò)增出221條條帶，其中多態(tài)性條帶有118條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出27.63條條帶和14.75條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)53.39%，遺傳相似系數(shù)為0.26～0.88，通過聚類分析，可將試驗(yàn)材料分為6個(gè)類群，在某些情況下，來自同一區(qū)域的多數(shù)品種聚為一類，且主要的遺傳變異(87.6%)發(fā)生在群體內(nèi)。通過遺傳距離的主坐標(biāo)分析表明AFLP分子標(biāo)記是進(jìn)行石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的有效工具。Ajal等[28]用6對(duì)引物對(duì)24個(gè)摩洛哥石榴品種進(jìn)行AFLP遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出519條條帶，其中多態(tài)性條帶有368條，多態(tài)性比率達(dá)70.91%。研究表明，摩洛哥石榴品種遺傳多樣性豐富，品種間的遺傳多樣性高于群體水平，UPGMA和PCA分析表明石榴品種具有的遺傳多樣性與地理起源和品種名稱無關(guān)，且AFLP技術(shù)可有效運(yùn)用于石榴品種區(qū)分及遺傳多樣性分析。

3 SSR分子標(biāo)記

SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是由Hamade在1982年發(fā)現(xiàn)的以DNA重復(fù)序列為核心的第二代分子標(biāo)記技術(shù)。SSR分子標(biāo)記以孟德爾方式遺傳，為共顯性標(biāo)記，具有等位基因、單基因座變異多、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、信息量高、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、種族特異性強(qiáng)、引物序列易交換、進(jìn)化所受選擇壓小等優(yōu)點(diǎn)，但引物開發(fā)設(shè)計(jì)需預(yù)先克隆和測(cè)序，成本較高且費(fèi)時(shí)費(fèi)力[29]。目前國內(nèi)外SSR分子標(biāo)記在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用(表3)。

在國內(nèi)，Jian等[30]采用SSR技術(shù)對(duì)18個(gè)國內(nèi)外主栽石榴品種和24個(gè)來自國內(nèi)山東、陜西、河南的地方石榴品種共42個(gè)品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，從59對(duì)SSR引物序列中篩選出18對(duì)進(jìn)行SSR擴(kuò)增，共得到42個(gè)等位基因，觀察到的雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.119～0.619(平均為0.381)、0.091～0.656(平均為0.402)。研究表明SSR分子標(biāo)記可有效運(yùn)用于石榴遺傳多樣性分析。潘海發(fā)等[31]使用SSR技術(shù)對(duì)10個(gè)石榴栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，利用篩選出的8對(duì)SSR特異引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出93條條帶，其中多態(tài)性條帶54條，多態(tài)性比率達(dá)58%，每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為11～12條，且通過3對(duì)SSR特異性引物(Pom13、Pom21、Pom24)可將10個(gè)品種區(qū)別開。通過聚類分析，在歐式距離平方系數(shù)閾值為14.00～15.00時(shí)，可將所有品種分為6大類，且品種之間有按照系譜聚類的趨勢(shì)。研究結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記為共顯性，每個(gè)位點(diǎn)的分辨力很高、重復(fù)性和穩(wěn)定性很好，SSR技術(shù)可有效運(yùn)用于石榴品種區(qū)分及遺傳多樣性分析。

在國外，Hasnaoui等[32]在2010年運(yùn)用SSR技術(shù)對(duì)27份突尼斯石榴品種進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，利用篩選的11對(duì)SSR特異引物對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到25個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量為1～4個(gè)，觀測(cè)雜合度(Ho)為0.037～0.592，研究結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記可以有效運(yùn)用于石榴品種遺傳多樣性分析。2012年，Hasnaoui等[33]采用SSR技術(shù)又對(duì)32份突尼斯石榴品種和1份意大利石榴品種共33份材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，從15對(duì)SSR引物中篩選12對(duì)特異引物對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增，共得到34個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量為2～4個(gè)，平均為2.83個(gè)。預(yù)期雜合度(He)為0.030～0.758，平均預(yù)期雜合度(He)為0.245, 觀測(cè)雜合度(Ho)為0.030～0.527，平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.243，多態(tài)信息含量(PIC)為0.031～0.525。Pirseyedi等[34]采用SSR技術(shù)對(duì)來自伊朗亞茲德資源圃的60份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用從80對(duì)SSR引物中篩選的58對(duì)特異引物對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到35個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量為3～5個(gè)，平均為2.90個(gè)。預(yù)期雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)分別為0.29～0.65和 0.15～0.87，多態(tài)信息含量(PIC)為0.26～0.61，平均為0.43。表明SSR分子標(biāo)記是對(duì)形態(tài)學(xué)的有效補(bǔ)充，也是進(jìn)行石榴遺傳資源多樣性分析的有效工具。Rania等[35]采用SSR技術(shù)對(duì)32份突尼斯石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，用13對(duì)SSR引物對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到40個(gè)等位基因和46個(gè)確定基因型，表明突尼斯石榴種質(zhì)資源在分子水平上具有較高的多樣性。聚類分析圖表明，32份突尼斯石榴種質(zhì)遺傳多樣性分類結(jié)構(gòu)與地理分布及命名無關(guān)。Parvaresh等[36]采用SSR技術(shù)對(duì)來自伊朗、日本、土庫曼斯坦、俄羅斯、意大利和美國的75份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。25對(duì)引物中的10對(duì)引物表現(xiàn)出12個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，38個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量為2～6個(gè)，平均為3.1667個(gè)，預(yù)期雜合度(He)為0.0132～0.6280，平均預(yù)期雜合度(He)為0.4231, 觀測(cè)雜合度(Ho)為0.0133～1.0000，平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.4399，多態(tài)信息含量(PIC)為0.0132～0.5588，平均為0.3583，通過對(duì)比這些國家不同石榴品種，伊朗石榴品種具有最高遺傳多樣性。

表3 SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的情況

注：Ho為觀測(cè)雜合度；He為預(yù)期雜合度; PIC為多態(tài)信息含量；GS為遺傳相似系數(shù)。

4 ISSR分子標(biāo)記

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記即簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間，是Zietkiewicz等[37]在1994年以DNA重復(fù)序列為核心、運(yùn)用PCR技術(shù)和重復(fù)序列技術(shù)組合發(fā)展起來的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記。ISSR分子標(biāo)記快速易操作，設(shè)計(jì)引物隨機(jī)無需預(yù)知基因組序列，同時(shí)具有AFLP、SSR、RAPD等分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，ISSR標(biāo)記以其高多態(tài)性已被廣泛應(yīng)用于石榴遺傳多樣性等研究(表4)。

在國內(nèi)，沈進(jìn)[38]采用ISSR技術(shù)對(duì)我國具有代表性的45份石榴品種進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，從45個(gè)ISSR引物中篩選出條帶清楚、重復(fù)性好的引物17個(gè)，對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出187條條帶，其中多態(tài)性條帶157條，平均每個(gè)引物11條，多態(tài)性比率達(dá)83.96%，表明我國石榴栽培品種遺傳背景較復(fù)雜。通過聚類分析，以遺傳距離19為閥值，45份石榴品種分為4個(gè)類群，分類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類不完全一致。趙麗華等[39]采用ISSR技術(shù)對(duì)我國47個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，篩選出多態(tài)性好的6個(gè)ISSR引物對(duì)我國47個(gè)石榴品種進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出120條條帶，其中多態(tài)性條帶為109條，多態(tài)性比率達(dá)90.83%，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.2945，平均Nei’s基因多樣度(H)為0.1897，平均Shannon 信息指數(shù)(I)為0.3091，遺傳距離為0.0750～0.4000，表明我國47個(gè)石榴品種間具有比較豐富的遺傳多樣性, 通過UPGMA 法構(gòu)建分子樹狀圖，以遺傳相似性系數(shù)(GS)0.7767為閾值，將47個(gè)石榴品種分為5個(gè)類群，分類結(jié)果與形態(tài)和地理分布無關(guān)。同時(shí)檢測(cè)到15條特異性條帶可作為11個(gè)石榴品種鑒定的參考性標(biāo)記。趙麗華[40]為了更有效地對(duì)石榴種質(zhì)資源進(jìn)行收集、保存及利用，采用ISSR技術(shù)對(duì)我國7個(gè)石榴主產(chǎn)區(qū)46個(gè)石榴品種進(jìn)行研究。研究表明：7個(gè)石榴種群遺傳多樣性從大到小依次為：山東種群>陜西種群>云南種群>河南種群>安徽種群>四川種群>新疆種群；7個(gè)石榴種群間的基因分化系數(shù)(Gst)為0.1911，表明在7個(gè)石榴種群間的遺傳變異為19.11%，種群內(nèi)的遺傳變異為81.89%，種群間遺傳分化較低；群間基因流的估測(cè)值(Nm)為2.1169，7個(gè)石榴種群間的遺傳相似性(I)為0.9218～0.9759，表明7個(gè)石榴種群間具有強(qiáng)大的基因流及很高的遺傳相似性，石榴品種間的遺傳多樣性可以維持。馬麗等[41]采用ISSR技術(shù)對(duì)我國82個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性較好的10個(gè)引物對(duì)我國82個(gè)石榴品種進(jìn)行擴(kuò)增, 共擴(kuò)增出186個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)178個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)95.69%，平均等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均 Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)、平均 Shannon信息指數(shù)(I)分別為1.9570、1.3024、0.2140、0.3567，品種間遺傳相似系數(shù)(GS)為0.4784～0.9946，表明我國82個(gè)石榴品種間具有豐富的遺傳多樣性, 通過UPGMA 法構(gòu)建分子樹狀圖，以遺傳相似性系數(shù)(GS)0.735為閾值，將82個(gè)石榴品種分為4個(gè)類群。ISSR聚類結(jié)果與以結(jié)實(shí)性、花瓣類型、籽粒硬度性狀為依據(jù)的分類結(jié)果有較高的吻合度，與地理生態(tài)環(huán)境也存在一定的相關(guān)性。

在國外，Ghobadi等[42]采用ISSR技術(shù)對(duì)24個(gè)伊朗石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，篩選出6個(gè)擴(kuò)增引物，多態(tài)性條帶為64條，24個(gè)伊朗石榴品種在65%相似性水平下分為5個(gè)類群，ISSR分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不一致。Narzary等[43]采用ISSR技術(shù)對(duì)印度49個(gè)野生石榴品種(代表8個(gè)不同群體)進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出17個(gè)引物擴(kuò)增出268條多態(tài)性條帶，多態(tài)性率達(dá)87.01%，遺傳距離0.05～0.45，平均為0.25，表明野生石榴具有較高的遺傳多樣性。Ajal等[44]采用ISSR技術(shù)對(duì)27個(gè)摩洛哥石榴品種的進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出8個(gè)引物擴(kuò)增出70條帶，其中多態(tài)性條帶為61條，多態(tài)性率達(dá)87.14%，遺傳距離0.12～1.00，平均為0.67，總基因多樣性參數(shù)和群體內(nèi)基因多樣性參數(shù)分別為0.35和0.32，且種群間基因流(5.8) 較大，ISSR聚類結(jié)果與品種的地理來源無關(guān)。

表4 ISSR分子標(biāo)記應(yīng)用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的情況

5 SRAP分子標(biāo)記

SRAP分子標(biāo)記 (sequence related amplified polymorphism) 即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，是Li和Quiros等[45]在2001年創(chuàng)立的一種新型的基于PCR特定引物的標(biāo)記系統(tǒng)。該標(biāo)記采用獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)，對(duì)基因的特定區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物長(zhǎng)17 bp，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增, 下游引物長(zhǎng)18 bp，對(duì)啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，由于其生物物種和個(gè)體的啟動(dòng)子、內(nèi)含子與間隔區(qū)域長(zhǎng)度大小不等而產(chǎn)生多態(tài)性，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離DNA條帶。SRAP為共顯性標(biāo)記，具有擴(kuò)增多態(tài)性高、重復(fù)性好、產(chǎn)率高、較易測(cè)序、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)[46]。目前國內(nèi)外SRAP分子標(biāo)記在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用(表5)。

在國內(nèi)，張四普等[47]采用SRAP技術(shù)對(duì)23個(gè)石榴基因型進(jìn)行遺傳多樣性分析，從25對(duì)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的7對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出1 380條條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出197.14條條帶，其中多態(tài)性條帶662條，多態(tài)性百分率為47.97%。基因型間的遺傳距離為0.0769～0.4131，進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看，在遺傳距離0.33處可將石榴基因型分為5個(gè)類群。研究結(jié)果表明，石榴基因型具有豐富的遺傳多樣性，SRAP技術(shù)可有效運(yùn)用于石榴基因型的遺傳多樣性分析。陳蕓等[48]釆用SRAP技術(shù)對(duì)21份新疆石榴種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，從36對(duì)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的16對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出271個(gè)位點(diǎn)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出16.94個(gè)位點(diǎn)和12.13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)194個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)71.59%。21份材料間的遺傳相似系數(shù)為0.63～0.89，平均為0.77。對(duì)21份材料進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看，在遺傳相似性系數(shù)為0.776時(shí)，可將21份材料分為5個(gè)類群。21份材料間的平均觀測(cè)等位基因(Na)為1.7122，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.3528，平均Nei’s基因多樣度指數(shù)(H)為0.1999，平均Shannon 信息指數(shù)(I)為0.3105。研究結(jié)果表明，遺傳多樣性最為豐富是新疆喀什地區(qū)石榴品種；SRAP聚類結(jié)果與石榴的表型特征具有一致性，SRAP技術(shù)可有效運(yùn)用于石榴基因型的遺傳多樣性分析。涂勛良[49]釆用SRAP技術(shù)對(duì)釆自四川省會(huì)理縣海潮石榴母本園的36個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，從100對(duì)隨機(jī)引物中篩選出擴(kuò)增帶清晰、重復(fù)性好的30對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出5 868個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)分布在100～2 000 bp之間，其中多態(tài)性位點(diǎn)4 032個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)98.04%。引物不同擴(kuò)增的多態(tài)性也不同，擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)分布在78～251個(gè)之間，平均每對(duì)引物擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)有134.40個(gè)?；贜ei-Li遺傳相似系數(shù)，將36個(gè)石榴品種進(jìn)行聚類分析，從親緣關(guān)系樹狀圖看, 在遺傳相似系數(shù)閾值為0.77處，可將36個(gè)石榴品種分為8個(gè)類群。

在國外，Ranade等[50]采用SRAP技術(shù)對(duì)印度63份石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，這63份石榴品種包括15份野生品種、34份半野生品種及14份栽培品種。利用篩選出的擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的12對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出259個(gè)位點(diǎn)，通過構(gòu)建進(jìn)化樹可以把印度63份石榴品種分成不同的遺傳譜系，使得所有的栽培品種(除CBd70)和野生品種(除W101)很好地區(qū)分開，而把半野生品種分成三個(gè)類群。栽培品種、半野生品種和野生品種之間檢測(cè)的最大和最小遺傳距離分別為0.94和0.12、0.97和0.24、0.95和0.38。表明印度63份石榴品種具有豐富的遺傳多樣性。Soleimani等[51]采用SRAP技術(shù)對(duì)伊朗63份來自五個(gè)不同地區(qū)的野生石榴、栽培石榴及觀賞石榴進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的13對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出250個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)133個(gè), 平均每對(duì)引物擴(kuò)增出19.23個(gè)位點(diǎn)和10.23個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率達(dá)53.20%。63份材料間的遺傳距離為0.10～0.37，平均為0.24。對(duì)63份材料進(jìn)行NJ法聚類分析，表明觀賞石榴與部分野生石榴親緣關(guān)系較近，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是進(jìn)行石榴遺傳多樣性分析的有效工具。

表5 SRAP分子標(biāo)記應(yīng)用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的情況

6 結(jié)論與展望

綜上所述，分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn)，已在石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中得到了廣泛應(yīng)用。分子標(biāo)記技術(shù)不但適合于石榴種內(nèi)水平，也適合于組內(nèi)種間水平遺傳多樣性的研究。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記對(duì)石榴種質(zhì)資源及遺傳多樣性的研究起到積極作用。利用分子標(biāo)記對(duì)石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)和鑒定，不僅有利于石榴種質(zhì)資源的收集、分類、保存、評(píng)價(jià)、綜合利用及分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、進(jìn)化等的研究，而且有利于從野生石榴資源中篩選優(yōu)良的栽培品種，為石榴新品種的育種創(chuàng)新提供遺傳學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記技術(shù)不受外界環(huán)境因素的影響，能夠直接分析遺傳物質(zhì)本身，不僅廣泛應(yīng)用于石榴遺傳多樣性分析研究，而且在遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面也得到應(yīng)用。生物技術(shù)快速發(fā)展，具備快捷、低成本、高通量等特性的分子標(biāo)記技術(shù)將不斷出現(xiàn)，隨著DNA提取方法的改進(jìn)、電泳帶和數(shù)據(jù)的自動(dòng)分析、與目標(biāo)基因密切相關(guān)分子標(biāo)記的篩選及cDNA 和 EST文庫的不斷構(gòu)建，分子標(biāo)記技術(shù)將不斷優(yōu)化，這將為今后石榴種質(zhì)資源研究工作提供更加可靠的技術(shù)支撐。

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ApplicationofMolecularMarkerinGeneticDiversityResearchofPunicagranatumGermplasm

Wang Qingjun1,2, Hao Zhaoxiang1, Luo Hua1, Zhao Lina1, Bi Runxia1, Zhao Yawei1

(1.ZaozhuangPomegranateResearchCenter,Zaozhuang277300,China; 2.CollegeofHorticultureScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.028

2016-12-19

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201204402)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程計(jì)劃項(xiàng)目(魯科字[2014]96號(hào))；棗莊英才集聚工程項(xiàng)目(棗政辦字[2016]23號(hào))；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016GNC110002); 山東省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展資金項(xiàng)目(2015);棗莊市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016NS09)

王慶軍(1987—)，男，碩士研究生，主要從事石榴種質(zhì)資源收集保存、創(chuàng)新利用等研究。E-mail:wangqingjun163@126.com

趙亞偉(1963—)，男，工程師，主要從事石榴種質(zhì)資源收集保存、創(chuàng)新利用等研究。E-mail: zzzyw5566@163.com

S665.4

A

1001-4942(2017)09-0146-10