孟冰冰， 于洪春*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系，黑龍江哈爾濱 150030)

東北黑土壤是非常珍貴的土壤資源，它具有質(zhì)地疏松、高肥力、供肥能力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。但隨著農(nóng)藥使用量及其種類的逐漸增加，使土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，土壤污染問題逐漸引起關(guān)注。為了保障食品安全，需要有效地對(duì)土壤環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控及檢測(cè)[2 - 3]?；谕寥罉悠坊|(zhì)復(fù)雜，含有較多有機(jī)酸、金屬離子和土壤微生物等[4 - 6]，在檢測(cè)中樣品凈化成為分析中的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有土壤中農(nóng)藥殘留凈化方式有固相萃取、凝膠滲透色譜(GPC)、液-液萃取和基質(zhì)分散萃取法(QuECHERS)[7 - 13]等。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對(duì)土壤中31種農(nóng)藥進(jìn)行定性和定量分析。主要采用NANO碳凈化方式，NANO碳是以碳為基礎(chǔ)的納米材料，其表面疏水、多孔和獨(dú)有的π電子系，容易和目標(biāo)化合物發(fā)生π-π作用，因此NANO碳凈化具有很強(qiáng)的吸附作用力和較大的吸附容量，是一種理想的吸附劑[14 - 17]。通過與上述4種凈化方式進(jìn)行比較可以得出，NANO碳凈化方式節(jié)省了前處理操作時(shí)間，凈化效果好，能夠廣泛應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)工作中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1290-6430超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；MassHunter 工作站；KQ-300GVDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Cleanert NANO碳凈化柱為Agela品牌。

標(biāo)準(zhǔn)品：氟蟲腈(Fipronil)、氟蟲脲(Flufenoxuron)、伏殺磷(Phosalone)、噠螨靈(Pyridaben)、馬拉硫磷(Malathion)、滅幼脲(chlorbenzuron)、殺撲磷(Methidathion)、辛硫磷(Phoxim)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、甲拌磷(Phorate)、吡蟲啉(Imidacloprid)、3-羥基克百威(Carbofuran-3-hydroxy)、滅線磷(Mocap)、抗蚜威(pirimicarb)、樂果(Dimethoate)、久效磷(Monocrotophos)、涕滅威砜(Aldicarb-sulfone)、克百威(Carbofuran)、敵敵畏(Dichlorovos)、氧化樂果(Omethoate)、殘殺威(Propoxur)、涕滅威(Aldicarb)、甲萘威(carbaryl)、異丙威(isoprocarb)、多菌靈(Carbendazim)、乙酰甲胺磷(Acephate)、滅多威(Thiodicarb)、甲胺磷(Methamidophos)、啶蟲脒(Acetamiprld)、仲丁威(Fenobucarb)、涕滅威亞砜(Aldicarb-sulfoxide)，均為德國(guó)Dr.品牌。

乙腈、甲醇(色譜純)；NaCl(科密歐)；MgSO4(美國(guó)Agilent公司)；甲酸(Sigma)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

黑土壤樣品采自東北哈爾濱郊區(qū)田地表層黑土壤，隨機(jī)稱取1 kg黑土壤樣品，在通風(fēng)干燥環(huán)境下將土壤樣品平鋪成2 cm厚度，晾干后，過20目尼龍篩，將過篩后的土壤樣品研磨，并過100目尼龍篩，土壤樣品保存于樣品袋中，待用。

1.2 樣品前處理

1.2.1樣品提取準(zhǔn)確稱取10 g土壤樣品，加入10 mL乙腈，漩混3 min，3 500 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至20 mL離心管中，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，漩混3 min，3 500 r/min下離心5 min，取5 mL上清液，使用氮?dú)獯蹈?，用乙腈定容? mL。

1.2.2樣品凈化將已溶解樣品的乙腈轉(zhuǎn)移至NANO碳凈化柱中，緩慢推出，反復(fù)抽推3次，濾液過0.22 μm 的針式濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3 儀器條件

采用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至0.001～0.5 mg/L后，進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)。液相參數(shù)設(shè)置如下：色譜柱為Agilent Extend-C18柱(50×2.1 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶0.1%甲酸水溶液(15∶85,V/V)；流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫箱溫度為30 ℃。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：選用ESI+源；MRM掃描模式；毛細(xì)管電壓為4 000 V；干燥器溫度為350 ℃；運(yùn)行時(shí)間為6 min，選擇離子見表1。

表1 儀器參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 NANO碳納米凈化柱凈化原理

NANO碳凈化柱在使用過程中不需要提前對(duì)凈化柱進(jìn)行活化，同時(shí)也不需要準(zhǔn)備固相萃取裝置和抽真空泵，可直接上樣。當(dāng)樣品通過凈化柱時(shí)，樣品中的有機(jī)酸、色素和磷脂等雜質(zhì)通過吸附作用被吸附到柱中，同時(shí)目標(biāo)化合物通過推力流出，其凈化方式簡(jiǎn)單、快捷、高效、凈化效果好。其中碳原子以sp2雜化為主，并可形成sp3雜化鍵，所以同時(shí)具有sp2和sp3的混合雜化狀態(tài)，能夠形成具有p軌道混合交疊的大π鍵，容易與化合物產(chǎn)生共軛效應(yīng)，形成具有大分子的共價(jià)鍵和的化合物。由于碳結(jié)構(gòu)內(nèi)部具有納米級(jí)別的空間，表面張力大，對(duì)于很多有機(jī)化合物具有良好的吸附能力，并且空間容量較其它吸附劑要大，所以僅需少量試劑和較短的時(shí)間就能達(dá)到對(duì)樣品的凈化效果。

本研究中將傳統(tǒng)液-液萃取法、固相萃取(SPE)法、凝膠滲透色譜(GPC)法、基質(zhì)分散萃取(QuECHERS)法和NANO碳凈化法進(jìn)行比對(duì)。其中，使用SPE法進(jìn)行前處理所需要時(shí)間為20 min，GPC為35 min，液-液萃取法40 min，QuECHERS為5 min，而使用NANO碳凈化法的前處理凈化時(shí)間僅需1 min。對(duì)這5種凈化方式分別做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到數(shù)據(jù)見表2。

表2 5種凈化方法的加標(biāo)回收率及RSD(%)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用GPC的回收率最好，其次是NANO碳凈化法，這兩種凈化方式的回收率都比較穩(wěn)定，31種農(nóng)藥的回收率差別小，其它三種凈化方式的回收率較前兩種凈化方式差。但是GPC的凈化時(shí)間較長(zhǎng)，所以使用NANO碳凈化法更有優(yōu)勢(shì)。從時(shí)間、回收率和精密度上綜合考慮這5種凈化方式，NANO碳凈化法具有前處理時(shí)間短、回收率和精密度均良好等優(yōu)勢(shì)，實(shí)用性和有效性強(qiáng)。

圖1 31種農(nóng)藥的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 31 kinds of pesticidesAccording to the order of peaks：1,Methamidophos；2,Acephate；2,Omethoate；4,Aldicarb-sulfoxide；5,Thiodicarb；6,Monocrotophos；7,Thiamethoxam；8,Carbofuran-3-hydroxy；9,Dimethoate；10.Carbendazim；11,Imidacloprid；12,Aldicarb；13,Aldicarb-sulfone；14,Propoxur；15,Dichlorovos；16,Carbofuran；17,Pirimicarb；18,Carbaryl；19,Isoprocarb；20,Methidathion；21,Fenobucarb；22,Malathion；23,Fipronil；24,Mocap；25,Chlorbenzuron；26,Phorate(Phorate)；27,Phosalone；28,Acetamiprld；29,Phoxim；30,Flufenoxuron；Pyridaben.

2.2 色譜柱的選擇

選用C18色譜柱對(duì)31種農(nóng)藥進(jìn)行分離，分別試驗(yàn)了Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱、Agilent Extend-C18色譜柱和Agilent Plus-C18色譜柱(規(guī)格均為50×2.1 mm,1.8 μm)。通過對(duì)三種色譜柱的考察，結(jié)果顯示：Agilent Extend-C18色譜柱的雙配位的鍵合技術(shù)，能夠同時(shí)鍵合脂溶性化合物和水溶性化合物，1.8 μm的粒徑提高了50 mm色譜柱的柱效，對(duì)31種農(nóng)藥的分離效果要比Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱和Agilent Plus-C18色譜柱好，因此選其作為分析柱。

2.3 儀器參數(shù)優(yōu)化

流動(dòng)相的選擇對(duì)農(nóng)藥化合物的分離和離子化有一定的影響，為了確保31種農(nóng)藥殘留離子化，本文選擇對(duì)水、5 mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果顯示使用0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相能夠使31種農(nóng)藥殘留離子化效率最高，并且具有高的靈敏度，目標(biāo)化合物峰形較好。

在液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用中，除了需要考慮目標(biāo)化合物在色譜柱的分離效果外，還應(yīng)當(dāng)考慮化合物的離子化效率問題。本實(shí)驗(yàn)中31種農(nóng)藥殘留全部使用電噴霧離子源ESI+模式，31種農(nóng)藥的色譜圖見圖1。

2.4 回收率和精密度

在土壤樣品中進(jìn)行0.005、0.05和0.5 mg/kg三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每一水平點(diǎn)做3組平行，得到結(jié)果見表3。

表3 UPLC-MS/MS測(cè)定31種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

根據(jù)表3得到31種農(nóng)藥的添加回收率在70%～120%之間，滿足殘留分析要求；RSD在0%～10%之間，能夠滿足日常對(duì)土壤樣品中31種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和及檢出限

準(zhǔn)確移取31種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別稀釋為0.001～0.5 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見表4。通過將土壤樣品進(jìn)行提取、凈化和采用UPLC-MS/MS法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)信噪比(S/N)=3得到31種農(nóng)藥的檢出限為0.001～0.003 mg/kg，根據(jù)S/N=10得到31種農(nóng)藥的定量限為0.003～0.033 mg/kg。

表4 保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

3 結(jié)論

本文通過使用NANO碳凈化柱對(duì)土壤樣品進(jìn)行凈化，方法操作簡(jiǎn)單，避免了人員操作產(chǎn)生的誤差；使用UPLC-MS/MS法對(duì)土壤中的31中農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。該方法降低了檢測(cè)的時(shí)間成本，提高了工作效率，因此在土壤農(nóng)藥殘留檢測(cè)上具有廣泛的應(yīng)用前景。