,,,,*

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系,山東威海 264300)

白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水有機(jī)成分分析

盛杰1,2,徐亞超1,紀(jì)海玉1,劉安軍1,*

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系,山東威海 264300)

本研究對(duì)白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水主要有機(jī)成分進(jìn)行定性和定量分析。首先使用指示劑法檢測(cè)蛋白質(zhì)或多肽以及生物堿;其次應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)小分子糖、氨基酸,頂空固相微萃取-氣相色譜法檢測(cè)乙醇含量;最后采用高效液相色譜法測(cè)有機(jī)酸種類和含量,頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)揮發(fā)性成分。研究發(fā)現(xiàn),黃水中含有氨基酸,不含多肽、蛋白質(zhì)和生物堿,pH為4.34,乙醇1.04 mL/100 mL,小分子糖含量11.01 mg/mL,氨基酸含量5.11 mg/mL,乙酸737.58 mg/100 mL,甲酸248.73 mg/100 mL,揮發(fā)性成分共有56種,其中酯類物質(zhì)占90.38%。結(jié)果表明,白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水的有機(jī)成分主要為小分子糖、氨基酸、乙醇、乙酸、甲酸和酯類物質(zhì)。

白酒,釀酒黃水,有機(jī)成分,定性定量分析

釀酒黃水是采用固態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)濃香類白酒時(shí)產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物,別名黃漿水[1-2]。濃香類白酒常以高粱、大米、小麥、豆類等作為主要原料,經(jīng)過(guò)加入曲種、送水于池內(nèi)后進(jìn)行發(fā)酵所得[3-4]。由于原料不同,副產(chǎn)物黃水中主要成分所含種類和含量也會(huì)有所不同。釀酒原料在進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程中,大分子物質(zhì)如淀粉、糊精,分解后的小分子物質(zhì)如還原糖、乙醇等,以及微生物菌種等成分均混合于水中,并且經(jīng)長(zhǎng)期在窖池底部沉積,形成黃水[4]。由此得出,黃水中所含物質(zhì)豐富,大體含淀粉、還原糖、酒精、單寧及色素等,除上述成分外,還存在大量酸類物質(zhì),以有機(jī)酸為主[5-6],酯類物質(zhì)也是釀酒黃水中常見的一類物質(zhì),其中以脂肪酸乙酯所占比例最多。

目前,在我國(guó)很多酒廠都是采用回窖發(fā)酵、培養(yǎng)人工窖泥、養(yǎng)窖等方式方法來(lái)處理釀酒黃水[7],雖然在一定程度上實(shí)現(xiàn)了釀酒黃水的資源化再利用,但沒有大范圍得到解決,很多釀酒黃水被作為廢棄物直接被排放到環(huán)境中,造成了黃水資源的浪費(fèi),而且對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。近年來(lái),基于黃水中含有的豐富營(yíng)養(yǎng)成分,科研技術(shù)人員充分探討研究黃水在各個(gè)領(lǐng)域的用途,以此找出更多新的應(yīng)用領(lǐng)域來(lái)提高釀酒黃水的使用價(jià)值。

本文系統(tǒng)分析了白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水可能的主要成分,旨在探尋其發(fā)揮主要抑菌作用的成分。前期研究證明:釀酒黃水對(duì)常見的致病菌細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌)以及根霉菌和青霉菌等部分霉菌都有明顯的抑菌性能;同時(shí)也證明了黃水的抑菌性能在高溫、低溫、紫外線照射、高糖、高鹽,金屬離子等外界條件的干擾下,都表現(xiàn)出較好的抑菌性能;這都為發(fā)酵工業(yè)副產(chǎn)物黃水的應(yīng)用提供思路,利用黃水的抑菌性能,可代替部分合成防腐劑作為天然保鮮劑應(yīng)用于食品中。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

白酒、釀酒黃水 江蘇大風(fēng)歌酒業(yè)有限公司;茚三酮、碘化鉀、草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸、95%乙醇、叔丁醇 均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械三廠;pHS-25型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;SAAB-57324SPME手動(dòng)萃取頭 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;HP5809氣相色譜/質(zhì)譜計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀 美國(guó)惠普公司;Waters e2695高效液相色譜儀 德國(guó)Waters公司;GC9700型氣相色譜儀 溫嶺市福立分析儀器有限公司;氫火焰檢測(cè)器(FID)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙縮脲定性實(shí)驗(yàn) 取黃水1 mL于試管中,先向試管中加入1 mL雙縮脲試劑A,搖勻,再向試管中加入2滴雙縮脲試劑B,振蕩搖勻,觀察顏色變化[8]。

1.2.2 茚三酮定性實(shí)驗(yàn) 取黃水1 mL于試管中,用滴管加入0.2%茚三酮乙醇試劑2滴,搖勻,沸水浴加熱2 min,待顏色穩(wěn)定后,冷卻,觀察顏色變化[9]。

1.2.3 碘-碘化鉀定性實(shí)驗(yàn) 取黃水1 mL于試管中,加入碘-碘化鉀試劑,觀察試管中顏色變化[10]。

1.2.4 頂空固相微萃取-氣相色譜法測(cè)乙醇含量 首先,手持萃取頭Hub(PDMS-100 μm)一端和手柄接入后將其插入GC進(jìn)樣口進(jìn)行活化。條件為230 ℃、30 min;色譜柱:石英毛細(xì)管柱DB-ALC2 30 m×0.53 mm×2 μm;柱溫40 ℃;氣化室溫度220 ℃;檢測(cè)器溫度220 ℃;解析條件220 ℃,解析時(shí)間60 s;用超純水配置濃度分別為1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mg/mL的一系列乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液;取標(biāo)準(zhǔn)溶液體積5 mL注入15 mL頂空瓶中,按0.15 g/mL加入氯化鈉鹽析劑,并加入1 mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作液(1000 μg/L),在頂孔瓶?jī)?nèi)放入攪拌磁子,并且隔墊將口密封,設(shè)置萃取溫度為50 ℃,平衡時(shí)間為5 min,萃取時(shí)間為30 min,后立即上樣進(jìn)行氣相色譜分析。以乙醇的峰面積作為縱坐標(biāo),乙醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;同理,首先量取1 mL黃水于容量瓶中,用重蒸水定容至5 mL,然后轉(zhuǎn)移至15 mL頂空瓶中,加入0.75 g氯化鈉鹽析劑與1 mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作液(1000 μg/L),放入攪拌磁子后隔墊密封;并放于磁力加熱攪拌器上加熱攪拌,后將SPME萃取頭萃取后的待測(cè)試樣立即進(jìn)行氣相色譜分析;所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次,標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析[11]。

1.2.5 酸度的測(cè)定 樣品過(guò)濾后,取50 mL于100 mL燒杯,在室溫下用pH計(jì)多次測(cè)量,待穩(wěn)定后,記錄pH;

1.2.6 有機(jī)酸含量和種類的測(cè)定 色譜柱:Spursil C18(250×4.6 mm×5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相:準(zhǔn)確稱取KH2PO44.0827 g,三蒸水溶解后定容至1000 mL容量瓶,磷酸調(diào)pH至2.8,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后于超聲波清洗器中脫氣30 min備用。標(biāo)準(zhǔn)品配置:分別稱以下有機(jī)酸,均放于50 mL容量瓶中,三蒸水定容至刻度,按表1配置各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,過(guò)0.45 μm的微孔纖維素濾膜備用。樣品過(guò)0.45 μm的微孔纖維素濾膜備用,上機(jī),根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中有機(jī)酸種類,采用外標(biāo)定量的方法,計(jì)算樣品中各物質(zhì)的含量[12-14]。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及色譜保留時(shí)間Table 1 Concentration and reserved time of normal sample

1.2.7 揮發(fā)性成分的測(cè)定 色譜條件:色譜柱:DB-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣溫度:250 ℃;載氣:He,99.999%;分流比:20∶1;程序升溫:初始溫度80 ℃,保持3 min,然后以3 ℃/min升至230 ℃,保持20 min。質(zhì)譜條件:質(zhì)量分離器:離子阱;離子源:EI;電離能量:70 eV;離子阱溫度:220 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延長(zhǎng)時(shí)間:2.5 min;掃描方式:全掃描;掃描范圍:50～1000 m/z;萃取頭(PDMS-100 μm)的處理:15 mL頂空瓶中裝入5 mL釀酒黃水,并封蓋,插入固相微萃取裝置,萃取溫度50 ℃,平衡時(shí)間5 min,萃取時(shí)間30 min。取出萃取頭,直接進(jìn)樣進(jìn)行GC-MS分析,解析時(shí)間10 min,化合物組成的分析以計(jì)算機(jī)NIST05譜庫(kù)檢索結(jié)果和人工譜圖解析相結(jié)合的方法確定,按面積歸一化法進(jìn)行定量[15-16]。

1.2.8 糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)備8只洗凈的試管,分別取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖液,加蒸餾水補(bǔ)齊1 mL,每個(gè)試管再加6%苯酚溶液1 mL,加濃硫酸5 mL,混勻,微振,靜置10 min,沸水浴中加熱15 min后,取出迅速冷卻至室溫,放置20 min。用紫外分光光度儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照以蒸餾水代替糖溶液,葡聚糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取稀釋梯度為25的黃水0.1 mL,加蒸餾水0.9 mL,6%苯酚1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,同樣用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖含量[17]?？偺呛坑?jì)算公式:C=N×C1,N為稀釋倍數(shù)250,C1為標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)。

1.2.9 氨基酸含量的測(cè)定 分別吸取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL的容量瓶,各加4 mL水、磷酸緩沖液0.5 mL和2%茚三酮標(biāo)準(zhǔn)液體0.5 mL,沸水浴煮沸15 min,冷卻后加水定容至25 mL,570 nm下測(cè)定吸光光度值。以氨基酸濃度為橫坐標(biāo),吸光光度值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取稀釋10倍的釀酒黃水1 mL放置于25 mL容量瓶中,按上面操作步驟測(cè)其吸光光度值[18]。氨基酸含量計(jì)算公式:C=N×C2,其中,N為稀釋倍數(shù)10,C2為標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀數(shù)。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行,采用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1黃水成分定性實(shí)驗(yàn)分析

由表2可看出,樣品中含氨基酸,不含多肽、蛋白質(zhì)和生物堿。這與Tan GX[18]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中含蛋白質(zhì)0.08%～0.27%不同,可能由于白酒發(fā)酵的原料、原料配比、原料質(zhì)量、窖齡、窖池質(zhì)量等因素的不同所致。

表2 釀酒黃水的定性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The qualitative analysis experimental results ofyellow water from wine fermentations

2.2頂空固相微萃取-氣相色譜法測(cè)定乙醇含量

圖1為部分濃度測(cè)試液體的乙醇色譜圖,圖2為乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,經(jīng)計(jì)算樣品中乙醇含量為1.04 mL/100 mL,可知,黃水中所含乙醇含量極低。

圖1 乙醇的色譜圖Fig.1 Chromatograms of ethanol注:曲線1是0.2 g/100 mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)品,曲線2是5倍稀釋樣品,曲線3是0.125 g/100 mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)品。

圖2 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The normal curve of ethanol

2.3釀酒黃水pH的測(cè)定及有機(jī)酸含量的測(cè)定

根據(jù)1.2.5實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定釀酒黃水的酸堿度可知,其pH為4.34。這與朱開憲[19]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水pH為3.85～6.71相吻合,同時(shí)也提示我們,在進(jìn)一步研究抑菌成分時(shí)是否與此酸度有直接關(guān)系。同時(shí),圖3、圖4分別為標(biāo)準(zhǔn)混合酸和釀酒黃水的HPLC圖,可知樣品中主要含草酸,甲酸,乳酸,乙酸和檸檬酸,其乙酸含量最多,為737.58 mg/100 mL,其次為甲酸,其含量為248.73 mg/100 mL。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)混合酸的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard mixed acid

圖4 釀酒黃水的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of yellow water

有機(jī)酸濃度(mg/100mL)保留時(shí)間(min)草酸31.335.707甲酸248.737.326乳酸32.029.350乙酸737.5810.177檸檬酸12.5013.058

2.4黃水揮發(fā)性成分的測(cè)定

圖5為釀酒黃水氣相色譜圖,表4與表5可知樣品中主要揮發(fā)性成分有56種,其中酯類面積百分比為90.38%,酯類物質(zhì)的大量存在,使得黃水可以作為香味物質(zhì)應(yīng)用于食品中,宋柯等人采用黃水提取香味成分應(yīng)用于香料中[20]。

圖5 釀酒黃水氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of yellowwater from wine fermentation

序號(hào)保留時(shí)間(min)化合物名稱面積百分比(%)12.577二戊醇0.09923.195丙烯醛0.03833.543二戊酮0.01043.967丙酸乙酯0.62554.3163-甲基-3-庚醇0.02564.548三甲基乙烯0.02775.051丁酸乙酯0.00485.399正戊醇0.01095.9412,3-丁二醇0.004106.653丁酸0.863117.9562-甲基丁酸丁酯0.006128.149異戊酸0.055138.4582-甲基丁酸0.051148.6893,4二甲基戊醇0.514159.418甲基戊基酮0.015169.457苯乙烯0.027179.767戊酸乙酯1.2541810.021戊酸0.0151910.676己酸甲酯0.0162012.302異己酸己酯0.0712112.649庚醇0.0222213.744丁酸丁酯66.012315.866己酸丙酯17.522416.550辛醇0.1252516.930對(duì)甲基苯酚抑菌性0.2912617.346己酸丙酯0.3502717.454庚酸乙酯0.7392817.667庚酸0.4262918.241苯乙醇0.044

續(xù)表

表5 釀酒黃水中主要的揮發(fā)性成分(%)Table 5 The main volatile componentsin yellow water from wine fermentation(%)

2.5釀酒黃水小分子糖含量的測(cè)定

圖6為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,經(jīng)檢測(cè)樣品所含總糖為11.01 mg/mL,這與朱開憲[19]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中還原糖含量為6～45 mg/mL相吻合。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The normal curve of glucose

2.6釀酒黃水氨基酸含量的測(cè)定

圖7為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,計(jì)算可知,樣品中氨基酸含量為5.11 mg/mL。這與朱開憲[19]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中總氮含量為2.7～3.5 mg/mL有所不同,但同時(shí)猜測(cè),這與發(fā)酵液原料和發(fā)酵液儲(chǔ)存時(shí)間等因素有直接的關(guān)系,同時(shí)氨基酸添加到釀?dòng)椭锌稍黾悠漉r味,作為防腐劑添加到食品中也增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖7 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Normal curve of ethanol

3 結(jié)論

釀酒黃水中成分復(fù)雜,其中主要包括糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、乙醇、酯等,由于原料等因素不同,成分更是有所差異。本研究綜合分析了釀酒黃水的主要成分,研究得出:釀酒黃水pH為4.34,乙醇含量1.04 mL/100 mL,有機(jī)酸主要含草酸、甲酸、乳酸、乙酸和檸檬酸,其中乙酸為737.58 mg/100 mL,其次為甲酸,其含量為248.73 mg/100 mL,為黃水中有機(jī)酸的應(yīng)用提供理論依據(jù),例如食醋的生產(chǎn)、有機(jī)酸鈣的生產(chǎn)等;揮發(fā)性成分有56種,其中酯類面積百分比為90.38%,小分子糖含量為11.01 mg/mL,氨基酸含量為5.11 mg/mL,這些有機(jī)成分都說(shuō)明了釀酒黃水有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,為白酒發(fā)酵副產(chǎn)物的廣泛應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Analysisoforganiccomponentsofyellowwaterfromliquorfermentation

SHENGJie1,2,XUYa-chao1,JIHai-yu1,LIUAn-jun1,*

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Department of Food Engineering,Weihai Ocean Vocational College,Weihai 264300,China)

In this study,qualitative and quantitative analysis of main organic components of liquor fermentation were made. Firstly,the indicator was used to detect the presence of proteins or peptides and alkaloids and pH was determined by pH meter. Secondly,the standard curve method was used to determine the content of small molecular sugar and amino acid and the ethanol content was determined by headspace solid phase microextraction gas chromatography. Finally,the classification and content of organic acids were determined by HPLC and solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry was used to analyze the volatile components. Experiments on the analysis of the components of yellow water from liquor fermentation showed that detection of amino acids,peptides,proteins and alkaloids were not detected,pH was 4.34,the content of ethanol was 1.04 mL/100 mL,the content of small molecule sugar was 11.01 mg/mL,the content of amino acid reached up to 5.11 mg/mL,the content of acetic acid was 737.58 mg/100 mL,the content of acetate formic acid was 248.73 mg/100 mL and a total of 56 kinds of volatile components were contained,the percentage of esters accounted for 90.38% of total volatile constituents. The results showed that small molecular sugar,amino acid,ethanol,acetic acid,formic acid and esters as the organic components were contained yellow water from liquor fermentation.

liquor;yellow water from liquor;organic components;qualitative and quantitative analysis

TS201.2

A

1002-0306(2017)19-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.042

2017-03-29

盛杰(1989-),女,碩士研究生,研究方向:功能性食品的研究與開發(fā),E-mail:270450819@qq.com。

*通訊作者:劉安軍(1963-),男,博士,教授,研究方向:功能性食品的研究與開發(fā),E-mail:laj@tust.edu.cn。

省部級(jí)農(nóng)業(yè)部項(xiàng)目(201303082-3)。