蛋白電泳在小麥種子真實(shí)性及純度鑒定中的應(yīng)用

楊蕭帆

[摘 要] 小麥種子的真實(shí)性與純度是小麥種子質(zhì)量的一個(gè)重要衡量指標(biāo)。準(zhǔn)確鑒定小麥種子的真實(shí)性與純度，對(duì)于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)等具有重大意義。目前存在幾大類(lèi)不同的測(cè)定方法：傳統(tǒng)鑒定法、生物化學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。本文主要基于過(guò)往各種小麥種子純度鑒定的基礎(chǔ)，利用SDS-PAGE凝膠蛋白電泳來(lái)鑒定小麥種子的純度。通過(guò)對(duì)煙農(nóng)、寧麥、江麥、濟(jì)麥4個(gè)品種的小麥各取100單粒進(jìn)行蛋白凝膠電泳，將得到的膠帶進(jìn)行差異性分析，得到4個(gè)品種小麥的純度鑒定結(jié)果。

[關(guān)鍵詞] 小麥種子；SDS-PAGE；純度；真實(shí)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] S512.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-7909（2017）21-63-4

種子純度及真實(shí)性是評(píng)價(jià)小麥種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定小麥良種的純度應(yīng)達(dá)到99%[1]。種子純度、凈度、發(fā)芽率和水分是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，4項(xiàng)指標(biāo)中純度是非常重要的，直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和農(nóng)民的收入[2]。因此，種子純度檢測(cè)工作是非常重要的。種子純度是指品種典型一致性的稱(chēng)度，即樣品中待測(cè)品種種子數(shù)或株數(shù)占供檢樣品種子總粒數(shù)或總株數(shù)的百分比，是體現(xiàn)種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，是種子分級(jí)和評(píng)定種子質(zhì)量?jī)?yōu)良程度的基本依據(jù)[3]。在生產(chǎn)上，種子純度檢測(cè)能防止種子混雜退化，提高種子品質(zhì)，并能延長(zhǎng)良種的使用年限，充分發(fā)揮良種種性。

目前存在幾大類(lèi)不同的測(cè)定方法：傳統(tǒng)鑒定方法（如幼苗形態(tài)鑒定、組織化學(xué)鑒定、田間小區(qū)種植鑒定[4]）、生物化學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。各種方法都有各自的局限性，如組織化學(xué)法是憑借苯酚和氫氧化鈉與種子各組織發(fā)生的顏色反應(yīng)，根據(jù)種子間穎果和種皮著色差異區(qū)別雜株的種子，而小麥品種之間種子組織對(duì)染料的反應(yīng)差異不大，很難以此鑒定種子純度[5]。

鑒于這種狀況，采用分子標(biāo)記檢測(cè)種子純度的研究在小麥[6]、水稻[7]等各種作物上陸續(xù)開(kāi)展。例如，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（SDS-PAGE）對(duì)10個(gè)玉米品種進(jìn)行醇溶蛋白遺傳多樣性分析[8]。

小麥種子中含有各種貯藏蛋白，不同品種所特有的蛋白組成能反映出該品種的基因組成[9]，且有不同的遺傳特性，能夠得到其清晰、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的電泳圖譜，對(duì)鑒別種子真實(shí)性及純度十分重要[10]。因此，可以利用SDS-PAGE凝膠電泳來(lái)分離和鑒定蛋白質(zhì)。另外，可以根據(jù)遷移率大小測(cè)定某些蛋白質(zhì)的分子量。通過(guò)獲得的蛋白質(zhì)譜帶可以測(cè)定小麥種子的純度，并鑒定小麥種子的真實(shí)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料。濟(jì)麥22、江麥919、煙農(nóng)19、寧麥14，均由中江種業(yè)提供。

1.1.2 儀器。電泳儀、搖床、離心機(jī)。

1.1.3 試劑。30%單體貯備液，4×分離膠緩沖液，4×濃縮膠緩沖液，10%過(guò)硫酸銨，10% TEMED，蛋白提取液，4×樣品緩沖液，電極緩沖液，固定液，G250染色液，R250染色液，快速脫色液，慢速脫色液，12.5%SDS-PAGE分離膠，5%DSD-PAGE濃縮膠。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 蛋白的提取。取濟(jì)麥、寧麥、江麥、煙農(nóng)4個(gè)品種的小麥種子單粒各100粒，將單粒磨碎成粉末狀，待用。將取得的單粒樣品置于1.5 mL離心管中，加入1.0 mL蛋白提取液，置于37 ℃的搖床中震蕩1 h。

1.2.2 樣品離心。將樣品置于4 ℃、1.2萬(wàn)rpm的離心機(jī)中離心15 min，取上清液。

1.2.3 樣品獲取。取60 μL相同濃度的樣品按4∶1比例加入樣品緩沖液。將樣品充分渦旋混勻并煮沸3～5 min待用。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)垂直凝膠電泳，凝膠厚度1 mm，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12.5%。組裝凝膠模具，按照說(shuō)明書(shū)組裝好灌膠模具。對(duì)于Bio-Rad的微型凝膠電泳系統(tǒng)，在上緊螺絲之前必須確保凝膠玻璃板和底部膠條緊密接觸，防止細(xì)微不匹配導(dǎo)致凝膠泄露。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結(jié)果計(jì)算出每個(gè)品種譜帶的Rf值[11]，用0、1表示電泳譜帶的有無(wú)，在相同Rf值位置上有蛋白質(zhì)譜帶的記為1，無(wú)帶記為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥種子總蛋白凝膠圖譜分析

根據(jù)所獲得的凝膠圖譜得到如圖1所示的4個(gè)品種小麥種子的蛋白差異比較，整理出結(jié)果如表1所示?？梢?jiàn)，總蛋白在不同品種間存在差異。所有供試品種的總蛋白共表現(xiàn)出40條譜帶，26條具有多態(tài)性。以圖1中最后一條譜帶的遷移率為1.00。江麥919與濟(jì)麥22之間共有18條共同譜帶，特征帶Rf值為：0.22，0.26，0.29，0.38，0.41，0.45，0.49，0.65，0.80。江麥919與寧麥14之間共有14條共同譜帶，特征帶Rf值為：0.10，0.12，0.13，0.16，0.25，0.26，0.35，0.38，0.49，0.58，0.65，0.75，0.80，0.84，0.94。江麥919與煙農(nóng)19之間共有22條共同譜帶，特征帶Rf值為：0.01，0.03，0.06，0.16，0.22，0.38，0.42，0.49，0.58，0.65，0.68，0.72，0.75，0.80，0.90，0.94。濟(jì)麥22與寧麥14之間共有17條共同譜帶，特征帶Rf值為：0.10，0.12，0.13，0.16，0.22，0.25，0.29，0.35，0.41，0.45，0.58，0.75，0.84，0.94。濟(jì)麥22與煙農(nóng)19之間共有23條共同譜帶，特征值Rf為：0.01，0.03，0.06，0.16，0.26，0.29，0.41，0.42，0.45，0.58，0.68，0.72，0.75，0.90，0.94。寧麥14與煙農(nóng)19之間共有25條共同譜帶，特征帶Rf值為：0.01，0.03，0.06，0.10，0.12，0.13，0.22，0.25，0.26，0.35，0.42，0.68，0.72，0.84，0.90。

由此可見(jiàn)，不同品種小麥之間的譜帶均存在差異。在SDS-PAGE系統(tǒng)中，谷蛋白譜帶豐富，譜帶的多態(tài)性較強(qiáng)，特征帶也較多。

圖1 各品種小麥種子電泳圖像

注：1、2、3、4依次為江麥919、濟(jì)麥22、寧麥14、煙農(nóng)19。

2.2 小麥種子純度鑒定

種子純度是種子質(zhì)量的主要指標(biāo)。種子純度的降低會(huì)明顯降低作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)[12]。從圖2可以看出，濟(jì)麥22的種子圖譜顯示出了較好的一致性，有些條帶較淺，可能是染色不均勻的原因，因此這批種子中無(wú)異種子。從圖3可以看出，22號(hào)種子在Rf值0.12處有明顯缺失，應(yīng)為異種子。

圖2 濟(jì)麥部分種子蛋白SDS-PAGE電泳純度圖譜

圖3 煙農(nóng)部分種子蛋白SDS-PAGE電泳純度圖譜

按上述方法利用Rf值對(duì)4個(gè)品種的小麥種子進(jìn)行分析，最后得到江麥919的種子純度為99%，濟(jì)麥22的種子純度為99%，寧麥14的種子純度為98%，煙農(nóng)19的種子純度為98%。

2.3 小麥種子真實(shí)性鑒定

種子的真實(shí)性是指一批種子所用品種、種或屑與文件（品種說(shuō)明書(shū)、標(biāo)簽等）是否相同，是否名副其實(shí)。按照國(guó)家規(guī)定，種子凈度、水分、發(fā)芽率、真實(shí)性和純度4項(xiàng)指標(biāo)都必須達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，否則就是不合格種子[13]。

由于依靠種子外觀鑒定種子真實(shí)性要求檢驗(yàn)員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，但易受主觀因素的影響。特別是現(xiàn)在絕大部分種子實(shí)行包衣后，利用籽粒形態(tài)鑒定法的可信度大大降低。因此，可以利用SDS-PAGE凝膠電泳圖譜來(lái)鑒別真假種子，依據(jù)某些特征值位置譜帶的有無(wú)進(jìn)行鑒定。如圖4所示為寧麥919的真種子與假種子對(duì)比，可見(jiàn)2號(hào)種子在上部分有多條Rf特征值的譜帶缺失，如0.07與0.10處的譜帶缺失，可判定為假種子。

3 討論

3.1 小麥種子蛋白多態(tài)性

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所選取的4個(gè)品種的小麥種子蛋白凝膠電泳圖譜表現(xiàn)出了較好的多態(tài)性，品種與品種之間表現(xiàn)出了較好的多態(tài)性，便于分析區(qū)別。

3.2 可行性分析

該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)SDS-PAGE電泳圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)不同小麥種子的SDS-PAGE的電泳譜帶均表現(xiàn)出較強(qiáng)的多態(tài)性。電泳圖譜的譜帶較為清晰，層次分明且多態(tài)性較強(qiáng)，能有效鑒定不同品種小麥種子間的差異。但是，由于試驗(yàn)過(guò)程中存在一些人為因素的影響，如染色不均勻、脫色不充分，或因點(diǎn)樣量的不同，從而影響品種鑒別的準(zhǔn)確性。

圖4 寧麥919真假種子對(duì)比

注：1為真種子，2為假種子。

但總體來(lái)說(shuō)，本次試驗(yàn)可證明，利用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行小麥種子真實(shí)性及純度鑒定分析是可行的。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 4404.1-2008，糧食作物種子 第一部分：禾谷類(lèi)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[2]辛景樹(shù)，郭景倫，張軟斌.幾種常用分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度和品種真實(shí)性鑒定方面的比較與分析[J].種子，2005（1）：58-60.

[3]國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 3543.5-1995，農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 真實(shí)性和品種純度鑒定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[4]Draper SR.ISTA committee report of the working group for biochemical of test for cultivar identification[J].Seed science and technology，1987（15）：431-434.

[5]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 19557.2-2004，植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 普通小麥[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[6]石海波，王立新，李宏博，等.用SSR標(biāo)記區(qū)別小麥品種種子混雜和SSR位點(diǎn)不純的研究[J].分子植物育種，2006（4）：513-519.

[7]Sundaram RM，Naveenkumar B，Biradar SK，et al. Identification of in formative SSR markers capable of distinguishing hybridrice parental lines and their utilization in seed purity assessment[J].Euphytica，2008（2）：215-224.

[8]康美玲，田忠景，張倩倩.利用醇溶蛋白電泳圖譜分析不同玉米品種的遺傳多樣性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（10）：321-327.

[9]鄭成超，金錫奎.種子蛋白電泳在品種純度鑒定中的應(yīng)用[J].種子，1990（3）：45.

[10]習(xí)莉，李亞蘭，李芳芳.聚丙烯酰胺電泳法測(cè)定小麥種子純度方法的改進(jìn)[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2002（2）：119-121.

[11]甘莉，王新.油菜種子貯藏蛋白的遺傳多樣性分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999（6）：528-532.

[12]田雷，曹鳴慶，王輝.AFLP標(biāo)記技術(shù)在鑒定甘藍(lán)種子真實(shí)性及品種純度中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2001（3）：3-14.

[13]劉德強(qiáng).種子真實(shí)性和品種純度的影響因素及鑒定方法[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（5）：92-97.