鯉IL-10錦鯉皰疹病毒核酸疫苗聯(lián)合免疫效果的研究

于 慧， 王 好， 祖岫杰, 康學會， 楊炳坤, 劉艷輝, 周井祥

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林省水產(chǎn)科學研究院 ， 吉林 長春 130033)

鯉IL-10錦鯉皰疹病毒核酸疫苗聯(lián)合免疫效果的研究

于 慧1， 王 好1， 祖岫杰2, 康學會2， 楊炳坤2, 劉艷輝2, 周井祥1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林省水產(chǎn)科學研究院 ， 吉林 長春 130033)

本研究選用鯉IL-10，構(gòu)建pEGFP-N1-IL-10真核表達質(zhì)粒，分別進行體外細胞轉(zhuǎn)染試驗和免疫魚的試驗，證明了重組質(zhì)粒在細胞中能成功表達，體內(nèi)免疫試驗ELISA結(jié)果顯示，抗體水平會隨著免疫次數(shù)、劑量的增加逐漸升高，三免后第1周的抗體水平最高，隨后抗體水平逐漸下降。相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，pEGFP-N1-IL-10與核酸疫苗pIRES-ORF81聯(lián)合免疫所產(chǎn)生抗體水平明顯升高，但差異不顯著(P>0.05)。

錦鯉皰疹病毒 ； 鯉白細胞介素10 ； 核酸疫苗pIRES-ORF81

錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease, KHVD)是能夠使鯉(Cyprinuscarpio)、錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)及其變種大量死亡的疾病，大面積暴發(fā)該病時，死亡率為80%～100%[1]。隨著全球水產(chǎn)品貿(mào)易迅猛發(fā)展，該病在世界范圍內(nèi)肆意傳播，難以控制，對鯉魚養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴重威脅。目前國內(nèi)外已經(jīng)有一些預(yù)防錦鯉皰疹病毒病疫苗的相關(guān)報道，且具有一定效果。

1989年 Fiorentino 等[2]首次發(fā)現(xiàn)白細胞介素 10 (Interleukin-10，IL-10)。IL-10可以在很多細胞中產(chǎn)生， 如T 細胞亞群，單核細胞，巨噬細胞等。已獲得多種哺乳動物的 IL-10 序列，以及非哺乳動物，禽類、鰻魚、鱒魚、河豚魚等的IL-10 序列。目前認為 IL-10 具有多種免疫活性，它可以誘導(dǎo)外周耐受和免疫抑制，還在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

本研究在核酸疫苗pIRES-ORF81作用的基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的pEGFP-N1-IL-10真核表達質(zhì)粒與該核酸疫苗聯(lián)合，進行同時免疫，來探究鯉IL-10對于錦鯉皰疹病毒病發(fā)揮哪種免疫功能。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 150條250～300 g的健康鯉魚數(shù)尾(購自長春雙陽某漁場)，平均體長18 cm，試驗前在吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院養(yǎng)魚室充氧的20 ℃水中飼養(yǎng)2周，研究中使用自然光周期。

1.2 主要試劑 多聚肌苷酸胞苷酸(PolyI:C)，購自南京生利德生物技術(shù)有限公司； TRIZol?Reagent，購至Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑、T4 DNA連接酶等，購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自AxyGen公司；L-15液體培養(yǎng)基、新生牛血清/胎牛血清，購自HyClone公司。

1.3 細胞、病毒與質(zhì)粒 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)由本實驗室分離保存[3];框鏡鯉尾鰭原代細胞由本實驗室繁殖保存；核酸疫苗PpIRES-ORF81質(zhì)粒由本實驗室保存[4]。

1.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)鯉IL-10 mRNA基因序列(GenBank上登錄的)，引物設(shè)計使用Primer Premiers 5.0軟件，上游引物P1序列：5′-AAGCTTATGGTTTTCAGTGGAGTCATCCTTT-3′；下游引物P2序列：5′-GAATTCAATCACGAACGGAGAGAAACTAC-3′。劃線部分依次為限制性酶切位點HindⅢ和EcoRⅠ，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。

1.5 IL-10基因的擴增、克隆及鑒定 試驗前18 h對試驗魚進行胞苷酸(500 mg/魚)注射，取新鮮鯉魚頭腎樣品及脾臟使用液氮對進行其充分研磨使之成粉末狀，利用TRIZol法提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行PCR反應(yīng)，采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下: 94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，58.1 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束 4 ℃ 保存。將回收的IL-10目的基因與pMD-18T克隆載體16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，經(jīng)篩選鑒定后，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 IL-10基因的真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 對測序正確的質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒分別用HindⅢ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定和回收， T4連接酶16 ℃連接過夜，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α中，篩選克隆菌落接種至含卡那霉素的培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定雙重鑒定，選取陽性質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-IL-10。

1.7 重組質(zhì)粒pEGFP-N1- IL-10在錦鯉鰭條細胞中的表達

1.7.1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10的大量提取與純化 將含有pEGFP-N1-IL-10質(zhì)粒的菌液擴搖至對數(shù)生長期，進行質(zhì)粒大提，方法參照AxyGen質(zhì)粒大量提取與純化說明書，使用分光光度計測定重組表達質(zhì)粒在260 nm波長時的吸光值，根據(jù)重組表達質(zhì)粒的濃度計算公式：質(zhì)粒濃度(μg/μL)=OD260×稀釋倍數(shù)×50 μg/mL。

1.7.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1- IL-10的轉(zhuǎn)染 用500 μL無血清培養(yǎng)基，分別稀釋3 μg重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10和9 μg EndoFectionTMMax轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻，室溫孵育5 min。在六孔板中，加入混勻的DNA-EndoFectionTM復(fù)合物，8字混勻后放入26 ℃培養(yǎng)箱孵育。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并采集圖片。分別提取細胞(轉(zhuǎn)染后)總RNA，方法與提組織RNA相似，再進行RT-PCR及PCR。

1.8 重組質(zhì)粒pEGFP-N1- IL-10與核酸疫苗聯(lián)合免疫魚試驗 免疫試驗前，將魚分6組，每組10尾，組1 滅菌的PBS；組2 空白對照組；組3 pIRES-ORF81；組4～6組pIRES-ORF81+pEGFP-N1-IL-10(劑量分別為1 μg、5 μg、15 μg)；注射劑量為200 μL/尾，三次免疫間隔14 d。尾靜脈采血于免疫前、一免及二免后第一、二周，三免后一到三周。收集血清，間接ELISA檢測抗體水平

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-10目的基因的擴增及鑒定 分別以提取的鯉魚頭腎RNA及脾臟RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再分別以IL-10的P1，P2序列為引物，通過PCR擴增得到與預(yù)期大小一致的540 bp的目的片段，如圖1。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對pMD18-T-IL-10陽性質(zhì)粒(PCR鑒定)分別進行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，在540 bp位置均有條帶，同時有一條2 000 bp以上條帶。與預(yù)期相符，說明成功構(gòu)建pMD18-T-IL-10，如圖2。

圖1 IL-10 PCR擴增產(chǎn)物

M： DNA分子量標準； 1：PCR產(chǎn)物(IL-10)

圖2 雙酶切鑒定pMD18-T-IL-10

M：DNA分子質(zhì)量標準； 1：雙酶切產(chǎn)物(pMD18-T-IL-10)

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10鑒定 分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10進行雙酶切。結(jié)果顯示的目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，在540 bp位置有條帶，同時有1條片段大小為4 645 bp的載體條帶。說明已經(jīng)成功將IL-10基因克隆到pEGFP-N1真核表達載體上，如圖3。

圖3 酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10

M：DNA分子質(zhì)量標準； 1：pEGFP-N1-IL-10酶切結(jié)果

2.3 重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10轉(zhuǎn)染至錦鯉鰭條細胞中，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到有質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細胞(如中插彩版圖4)。

2.4 RT-PCR檢測真核表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染成功后的細胞用TRIZol裂解，提取細胞總RNA，RT-PCR，以cDNA作為模板，用P1，P2作為引物進行PCR檢測。電泳后分別在位置540 bp處觀察到目的條帶，說明pEGFP-N1-IL-10已轉(zhuǎn)染成功，如圖5。

圖5 IL-10基因的PCR擴增結(jié)果

M：DNA 分子質(zhì)量標準； 1：IL-10PCR產(chǎn)物

2.5 鯉魚血清中抗體水平ELISA檢測結(jié)果 注射前要進行一次采血，再向不同試驗組鯉魚分別注射對應(yīng)的免疫劑，一免及二免后第1周和第2周，三免后第1～3周，尾靜脈采血。采用間接ELISA法檢測注射免疫劑后鯉魚血清中的抗體水平。通過平均數(shù)和標準差的計算，最終得出圖中數(shù)據(jù)。圖6為結(jié)果，依圖所見，除了PBS組和空白組，其他各組鯉魚血清中均能檢測出KHV特異性抗體，免疫次數(shù)增多抗體水平隨之增加。三免后1周，抗體水平達到峰值，之后趨于下降。增加質(zhì)粒濃度抗體水平稍有增加，但不明顯。PBS組和空白組這兩組與注射重組質(zhì)粒組的抗體水平差異顯著(P<0.05)?；旌现苿﹑EGFP-N1-IL-10+pIRES-ORF81，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81抗體水平有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；

圖6 不同劑量各組的血清抗體水平曲線

3 討論

IL-10是多效細胞因子，具有免疫刺激、免疫抑制雙重免疫調(diào)節(jié)活性。IL-10能夠促進B細胞及天然殺傷性細胞的分化和增殖，促進單核細胞和巨噬細胞及肥大細胞集落[5]。在免疫反應(yīng)中，IL-10能夠平衡組織損傷及阻止病原入侵，在對抗病原體的過程中能夠減輕炎癥反應(yīng)，保護組織免受過分的炎癥反應(yīng)損傷。因此該細胞因子具有一定的特殊性，目前，在許多哺乳動物上已經(jīng)有過對 IL-10 的研究，但是對于低等脊椎動物 ，IL-10 的研究還很少。特別是關(guān)于鯉IL-10的報道十分有限[6]。馮祥汝等[7]通過研究IL-10 在鯉魚不同組織部位中的表達情況證明了IL-10 參與鯉魚的早期免疫反應(yīng)。

Segal B等[8],證明了在某些情況下，IL-10通過先天性免疫和適應(yīng)性免疫，也能夠?qū)盒约毎拿庖叻磻?yīng)產(chǎn)生積極作用。在接種抗癌疫苗之前給予 IL-10 能導(dǎo)致免疫抑制及腫瘤的形成，這與 IL-10 對 DC 的抑制作用一致。但是，在免疫接種之后注射 IL-10 能明顯增強其抗腫瘤免疫效果。

并且，同時注射疫苗和 IL-10的動物體內(nèi)經(jīng)受過抗原刺激的 CTL水平明顯高于只注射了疫苗的動物，表明IL-10 可以作為免疫佐劑維持 CTL 的水平。

本試驗通過體外轉(zhuǎn)染試驗證明了構(gòu)建的真核質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10可在鯉魚鰭條細胞中表達，采用pEGFP-N1-IL-10+pIRES-ORF81、聯(lián)合免疫制劑對試驗魚進行免疫，結(jié)果表明，抗體水平隨著免疫次數(shù)增多而有所增加，在三免后1周抗體水平趨于下降。3種劑量均獲得很好的免疫效果，且低劑量的核酸疫苗就可獲得較好的抗體水平。重組質(zhì)粒濃度增加，抗體水平隨之增加，結(jié)果是具有顯著差異的，由此可見，針對錦鯉皰疹病毒病，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，聯(lián)合免疫制劑所產(chǎn)生的抗體水平更高，免疫效果更好，鯉IL-10可作為免疫佐劑以提高所接種疫苗的效果。

未來希望可以通過調(diào)控 IL-10 水平來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，但是由于該因子的特殊性，我們很難掌握免疫刺激和免疫抑制之間的平衡狀態(tài)，因此調(diào)節(jié)該細胞因子也具有較高的風險，我們必須掌握好最佳IL-10 的劑量以達到預(yù)期的免疫效果。

[1] Taylor N G H, Dixon P F, Jeffery K R,etal. Koi herpesvirus: distribution and prospects for control in England and Wales[J]. Journal of Fish Diseases, 2010, 33(3):221-230.

[2] Fiorentino D F, Bond M W, Mosmann T R. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones[J]. The Journal of experimental medicine, 1989, 170(6): 2081-2095.

[3] 朱霞, 李新偉, 王好,等. 一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學報, 2011, 33(5):340-343.

[4] 李新偉.錦鯉皰疹病毒ORF25、ORF81基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性的研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學, 2012.

[5] Sabat R, Grutz G, Warszawska K,etal. Biology of interleukin-10[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2010, 21: 331-344.

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[7] 馮祥汝，陳義龍，盧強.白細胞介素-10 的生物學功能及其在疾病中的作用研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2012,39(3):74-77.

[8] Segal B,Glass D,Shevach E.Cutting edge:IL-10-producing CD4+-T cells mediate tumor rejection[J].Immunol,2002,168:1-4.

征訂啟事

2017年本刊征訂工作已結(jié)束，未在當?shù)剜]局(所)訂到2017年本刊的讀者，可直接從郵局匯款至本刊編輯部訂閱。全年共12期，每期定價：16.00元，全年192.00元，不收郵費。歡迎訂閱！編輯部地址：北京市海淀區(qū)圓明園西路2號、中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，電話：010-62733040，郵編：100193。

《中國獸醫(yī)雜志》編輯部

ImmuneeffectofcarpInterleukin-10andKoiHerpesvirusnucleicacidvaccinecombinedimmunization

YU Hui1, WANG Hao1, ZU Xiu-jie2, KANG Xue-hui2, YANG Bing-kun2, LIU Yan-hui2, ZHOU Jing-xiang1

(1.Institute of Animal Science and Technology of Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2.Jilin Academy of Fishery Sciences, Changchun 130033， China)

The eukaryotic recombinant plasmid pEGFP-N1-IL-10 were constructed based on IL-10 mRNA. In vitro cell transfection experiment , proved that the recombinant plasmid was successfully expressed in cells .ELISA results showed that antibody levels increased gradually with the increase of number and dose of immunization, The highest antibody level was on the first week after three immune. Then the antibody levels gradually declined. Compared with the single nucleic acid vaccine pIRES-ORF81, antibody levels in fish immunized with the combination of pEGFP-N1-IL-10 and nucleic acid vaccine pIRES-ORF81 increased , but it was not significant (P> 0.05).

Koi herpes virus ; Carp interleukin 10 ; Nucleic acid vaccine pIRES- ORF81

s:ZHOU Jing-xiang ； LIU Yan-hui

S942.5

A

0529-6005(2017)08-0083-04

2016-08-01

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(CARS-46-29)；吉林省自然科學基金項目(20140101035JC)

于慧(1990-)，女，碩士生，從事動物病毒分子學研究，E-mail：1150520227@qq.com

周井祥，E-mail：zhjxnd@126.com；劉艷輝，E-mail：liuyanhui9@163.com