朱鶴云 ， 費 雪 ， 孫宇慧 ， 王黎明 ， 郝乘儀 ， 馮 波 ， 關 皎

(吉林醫(yī)藥學院藥學院 ， 吉林 吉林 132013)

UFLC法同時測定防己中粉防己堿和防己諾林堿的含量

朱鶴云 ， 費 雪 ， 孫宇慧 ， 王黎明 ， 郝乘儀 ， 馮 波 ， 關 皎

(吉林醫(yī)藥學院藥學院 ， 吉林 吉林 132013)

為了建立超快速液相色譜法(UFLC)同時測定防己中粉防己堿和防己諾林堿的含量，為防己藥材的質量控制提供參考。方法：采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm × 3.0 mm,2.2 μm)；以乙腈-0.2%磷酸水(三乙胺調(diào)pH值至8.0)(65∶35,v/v)為流動相；流速為0.8 mL/min；檢測波長為282 nm；柱溫為30 ℃。結果：粉防己堿和防己諾林堿分別在10-500 μg/mL(R = 0.999 9)和10-500 μg/mL(R = 0.999 9)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；平均回收率(n= 9)分別為98.0%和99.1%。表明該方法結果準確、操作簡便、具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可用于防己藥材的質量控制，同時為新獸藥開發(fā)利用提供參考。

防己 ； 粉防己堿 ； 防己諾林堿 ； 超快速液相色譜法

防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandra.S.Moore.的干燥根[1]，性苦，寒，歸膀胱、肺經(jīng)，具有利水消腫、祛風止痛之功效[1]。防己中的主要化學成分為生物堿，其中粉防己堿和防己諾林堿為主要活性成分，2015年版《中國藥典》將粉防己堿和防己諾林堿作為防己藥材質量控制的主要指標。目前，文獻報道的防己的質量控制方法主要包括毛細管電泳法[2]、化學發(fā)光法[3]和高效液相色譜法[4-6]。然而，這些方法存在專屬性差、流動相組成復雜、分析時間長、樣品處理復雜等缺點。近年來，超快速液相色譜(Ultra-fast liquid chromatography,UFLC)技術由于在峰容量、分析效率、靈敏度和分辨率方面均優(yōu)于常規(guī) HPLC，并可在極短的時間內(nèi)達到柱平衡或重新平衡，顯著減少分析時間，同時相應會減少溶劑消耗，已越來越多的應用于中藥成分分析研究[7-8]。本研究首次采用超快速液相色譜法測定防己中粉防己堿和防己諾林堿的含量，所建立的定量分析方法分析時間短，分析效率明顯提高，可為防己的質量評價提供科學依據(jù)，同時為天然藥物應用于獸醫(yī)獸藥領域提供參考。

1 儀器與試藥

Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

乙腈、甲醇均為色譜純(美國Fisher科技)，所用水為經(jīng)過Milli-Q型超純水儀凈化后的超純水，其他試劑均為分析純。對照品粉防己堿(批號：110711-201609)和防己諾林堿(批號：110793-201606)，購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。

防己藥材購自吉林市吉林大藥房，產(chǎn)地為江西省，經(jīng)吉林醫(yī)藥學院生藥教研室李景華副教授鑒定為防己科植物粉防己Stephani0atetrandra.S. Moore.的干燥根，樣本留存于吉林醫(yī)藥學院藥學院中藥樣品室。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取對照品粉防己堿、防己諾林堿對照品適量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成含粉防己堿 1 mg/mL、防己諾林堿1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取防己藥材粉末(過40目篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷后再稱重，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm,內(nèi)徑: 2.2 mm)，預柱為C18保護柱(4 mm×3.0 mm, 內(nèi)徑:2.2 mm)，流動相為乙腈-0.2%磷酸水(三乙胺調(diào)pH值至8.0)(65∶35,v/v)，流速為 0.8 mL/min；檢測波長為282 nm；柱溫為30 ℃，進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)色譜圖1：防己諾林堿(fangchinoline); 2：粉防己堿(tetrandrine)

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下的粉防己堿和防己諾林堿對照品溶液適量，置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇-水(70∶30,v/v)配制成粉防己堿和防己諾林堿濃度均為10,20,50,100,200 μg/mL和500 μg/mL的系列混合對照品溶液，依次注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以所含對照品的濃度X(μg/ml)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，粉防己堿和防己諾林堿的回歸方程分別為：

Y=3.329×103X+1.834×104R=0.999 9

Y=5.005×103X+7.773×104R=1

結果表明，粉防己堿、防己諾林堿濃度分別在10-500 μg/mL、10-500 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.4”項下制備的第4混合對照品溶液5 μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果粉防己堿、防己諾林堿峰面積的RSD(n=6)分別為0.4%和0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定，記錄峰面積。結果粉防己堿、防己諾林堿峰面積的RSD分別為1.6%，0.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 取同一批防己樣品6份，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣5 μL，計算粉防己堿、防己諾林堿的含量，結果上述2種成分的含量的平均值(n=6)分別為0.40%和1.42%；RSD分別為2.3%和0.6%，表明方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量(粉防己堿和防己諾林堿含量分別為0.40%和1.42%)的防己樣品粉末9份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入相當于樣品中粉防己堿和防己諾林堿含量的80%，100%，120%的對照品溶液適量，各3份。按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL測定，計算粉防己堿和防己諾林堿的回收率和RSD，結果見表1。

表1 防己樣品中粉防己堿和防己諾林堿的回收率

2.9 樣品含量測定 精密稱取6批防己樣品粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣5 μL，計算粉防己堿和防己諾林堿的含量。6批樣品測定結果見表1。

表2 防己樣品中防己堿和防己諾林堿的含量(%，n=6)

3 討論

3.1 流動相的優(yōu)化 分別考察了乙腈-0.2%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至8)、甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液、乙腈-甲醇-水-冰醋酸(40∶30∶30∶1)(每100 ml含十二烷基磺酸鈉 0.41 g)和乙腈-0.2 mol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液共4種流動相體系，結果表明，乙腈-0.2%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至8)作為流動相時能夠獲得較好的分離效果，分析時間為3 min，與文獻[7-9]中采用常規(guī)HPLC相比分析時間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定，適合于防己藥材的高通量分析。

3.2 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器(DAD)進行全波長掃描，粉防己堿和防己諾林堿在282 nm和215 nm處有最大吸收，其中215 nm 波長處靠近末端吸收,干擾較大。綜合考慮雜峰影響，基線平穩(wěn)，色譜峰峰形，最大吸收等因素，本試驗選擇282 nm作為檢測波長。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇 本試驗對比了回流法和超聲法提取防己中粉防己堿和防己諾林堿的提取效果。結果表明，超聲提取30 min所得供試品中上述兩種活性成分的含量明顯高于回流提取法。本試驗對比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液對防己中2種活性成分的提取效率，結果顯示，70%甲醇的綜合提取效率最高，故本試驗采用70%甲醇作為提取溶劑。

3.4 本研究建立UFLC法同時測定防己中粉防己堿和防己諾林堿的含量，并應用該方法測定了6批防己中上述2種活性成分的含量。購自吉林大藥房的6批防己均符合藥典要求(藥典規(guī)定防己中含粉防己堿和防己諾林堿的總量不得少于1.60%)。本研究建立的分析方法簡單、快速、重復性好，可用于防己藥材的質量控制。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 2015 年版一部[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2015: 148-149.

[2] 李玉琴，陳興國，齊永秀，等. 非水毛細管電泳法測定防己及其制劑中防己諾林堿和防己堿的含量[J]. 中國中藥雜志，2007,32 (19): 1 992-1 995.

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SimultaneousdeterminationoftetrandrineandfangchinolineinStephaniatetrandraS.MoorebyUFLC

ZHU He-yun , FEI Xue , SUN Yu-hui , WANG Li-ming , HAO Cheng-yi , FENG Bo , GUAN Jiao

(College of Pharmacy, Jilin Medical University， Jilin 132013, China)

To establish an ultra-fast liquid chromatography (UFLC) method for simultaneous determination of tetrandrine and fangchinoline inStephaniatetrandraS. Moore. Chromatographic separation was performed on Shim-Pack XR-ODS column (75 mm × 3.0 mm,2.2 μm). The mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphate acid (triethylamine adjust pH to 8.0)( 65: 35,v/v) and the flow rate was 0.8 mL·min-1.The detecting wavelength was set at 282 nm and column temperature was maintained at 30 ℃. The linear ranges were 10-500 μg·mL-1(r=0.999 9) for tetrandrine and 10-500 μg·mL-1(r=0.999 9) for fangchinoline. The average recovery (n=9) of tetrandrine and fangchinoline were 98.0% and 99.1%,respectively. The developed method is simple,accurate with high repeatability and stability,which is suitable for the quality control ofStephaniatetrandraS. Moore.,and can provide references for the development and utilization of new veterinary drugs.

StephaniatetrandraS. Moore ; Tetrandrine ; Fangchinoline ; UFLC

GUAN Jiao

R917

A

0529-6005(2017)08-0091-03

2017-04-24

吉林市科技局杰出青年基金項目(20166031)；吉林市科技局杰出青年基金項目(20166029)

朱鶴云(1982-)，男，講師，博士，研究方向為中藥質量控制及藥代動力學，E-mail:zhy19820903@126.com

關皎，E-mail：rainbowguanjiao@sina.com